Summary
Denna video visar hela montera immunohistokemi, en metod som den rumsliga och tidsmässiga uttryck mönster av ett antigen kan visualiseras i unga kycklingembryon. Denna metod introducerades ursprungligen av Jane Dodd och Tom Jessell.
Abstract
Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera antikroppar uttryck i att utveckla hjärnan, neuralrörsdefekter och somit. Denna video visar de olika stegen i hela montera antikropp färgning med HRP konjugerade sekundära antikroppar, det första är embryot skäras ut från ägget och fasta i paraformaldehyd. För det andra, endogen peroxidas är inaktiverat, Embryot är då utsätts för primär antikropp. Efter flera tvättar, är embryot inkuberas med sekundär antikropp konjugerad med HRP. Peroxidasaktivitet avslöjas med hjälp av reaktion med Diaminobenzidin substrat. Slutligen är embryot fast och behandlas för fotografering och sektionering. Fördelen med denna metod över användningen av fluorescerande antikroppar är att embryon kan behandlas för vax sektionering, vilket gör det möjligt att studera antigen platser i genomskärning. Denna metod introducerades ursprungligen av Jane Dodd och Tom Jessell
Protocol
I. Schematisk översikt:
Denna video visar de olika stegen i hela montera immunohistokemi i kycklingembryo. För det första är embryot fastställs i PFA [IHC1]. Då är endogen peroxidasaktivitet kylda [IHC2]. Embryot är då inkuberas i primära antikroppen [IHC3]. Efter flera tvättar, är embryot inkuberas i sekundär antikropp [IHC4]; färgreaktion avslöjas med hjälp av DAB [IHC5] och antikroppar färgning visas Orange [IHC6].
Del 1: Fastställande av embryon
- För att utföra hela montera immunohistokemi på kycklingembryon, först öppna ett ägg genom att knacka på skalet med pincett och ta bort bitar av skalet.
- Ta bort den tjocka albumin med pincett, och luta gulesäcken med grovt pincett så att embryot vänt uppåt.
- Använda fin sax, klippa en kvadrat med gulesäcken runt embryot. Ta bort embryot från äggulan med en sked och placera i en skål med PBS.
- Enligt en dissektion mikroskop försiktigt bort membran och äggula och ett embryo transfer till en ny maträtt som innehåller PBS.
- Pin embryot ner med pincett och insekter stift, och aspirera PBS. Ersätt denna med 4% PFA i PBS, och låta embryot att fixa 1h vid RT.
Del 2: Förberedelser embryon för antikroppar steg
- För att minimera potentiella mikrobiell kontamination, använd DDH 2 O i alla följande steg.
- När embryot är fast, aspirera Fixeringslösning och släng riktigt som kemiskt avfall. Fyll skålen med PBS.
- nästa med hjälp av en microdissection kniv, skär en fyrkant runt embryo att ta bort extraembryonic membran. Ta bort insekt stift med pincett.
- När stiften har tagits bort, med en slö slut pasteurpipett att överföra embryot till en scintillation injektionsflaskan med PBT (PBS pH 7,4, 0,5% Triton X).
- Tvätta embryo med PBT, 3 gånger i 10 minuter vardera.
- Ta PBT från scintillation flaskan, och ersätt med PBTx som innehåller 0,3% H 2 O 2 för att inaktivera eventuella endogen peroxidas.
- Inkubera i 2 tim vid RT på nutator.
- Tvätta embryo med PBT, 3 gånger 10 minuter vardera, därefter 3 gånger i 30 minuter vardera.
Del 3: Antibody inkubation
- Att färga embryo med antikroppen, börja med att tvätta embryot i en timme med blockerande buffert eller 1% BSA / 1% NGS / PBT (vi använder NGS eftersom den sekundära antikroppen är uppvuxen i get). Inkubera på nutator i en timme vid RT.
- Späd den primära antikroppen 01:01 i blockerande buffert, och inkubera embryo i denna lösning i 2 dagar vid 4 ° C på nutator. Primära antikroppen spädningsfaktorn beror på valet av primär antikropp. Här använder vi en antikropp från utvecklingsstudier Hybridoma Bank, som erbjuds som supernatent. Vi späda den 01:01 i blockerande buffert.
- nästa, utföra tre 10-minuters tvättar i PBT, följt av 3 1-timmes tvättar i PBT.
- Efter tvättning, späd sekundär antikropp 1:2500 i blockerande buffert (i det här fallet peroxidas konjugerad-get-anti-mus-IgG (H + L) och inkubera embryo i denna lösning O / N vid 4 ° C på nutator.
- Utför tre 10-minuters tvättar i PBT, följt av 3 1-timmes tvättar i PBT.
Del 3: färgreaktion
- Att utveckla färgförändring av de färgade embryot, först utföra två 20-minuters tvättar i Tris-buffert (100 mm Tris HCl, pH 7,4).
- Under tiden löser DAB substrat (3,3 '-Diaminobenzidin tetrahydrochloride) i Tris-buffert vid 500μg/ml i dragskåp, hålla lösning i mörkret, på is.
- Ta bort sista Trisbuffert tvätta från flaskan innehåller embryot och ersätt med 5ml DAB-lösning från steg 3,2. Förvara i mörka om nutator i 20 minuter. Kasta Eppendorf spets i hink med en 10% blekmedel lösning för att sanera DAB.
- Under tiden förbereder en 0,3% lager H 2 O 2 i dH 2 O på is.
- Lägg 50μl lager H 2 O 2 till injektionsflaskan med embryon i DAB. Förvara i mörker. Efter 1-2 minuter, övervaka reaktion under mikroskop.
Del 4: Embryo bearbetning för fotografering och histologi
- När färgreaktion är klar, kassera DAB i blekmedel hink. Ersätt med 5 ml kranvatten.
- Utför två 10-minuters tvättar i PBS.
- För att processen för fotografering och vax sektionering, torkar i en etanol-serien (25%, 50%, 75% och 100%) i 10 minuter vardera.
- Byt ut etanol med 0,5 - 1 ml cederträ olja (detta gör embryot genomskinliga). Process för fotografering i cederträ olja.
- Efter fotografering, tillbaka embryot till flaskan och ersätta cederträ oljan med 100% etanol. Upprepa etanol steg.
- Ersätt ethanol med 5% Snabb grön-orange i 100% etanol och inkubera i 3 minuter (detta steg kommer att göra embryon synlig för histologi). Byt Snabb grön-orange lösning med 100% etanol och process för histologi.
Representativa resultat:
I exemplen nedan, är embryon dissekeras på skeden HH 10 (A), 12 (B) och 11 (C), Embryon visar uttryck av PAX 7 i framväxande neurala crestas samt i somites och neuralrörsdefekter (A, B); I (C), är notochord märkt med 15.3B9 (ej-1) (Antikroppar som utvecklingsstudier Hybridoma Bank).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video visar de olika stegen för att utföra hela montering antikroppar färgning hos unga kycklingembryon. Detta protokoll är i huvudsak använts för den rumsliga och tidsmässiga karakterisering av nya antikroppar i chick 2,3, liksom för användningen av kända antigen markörer för att bestämma embryonala missbildningar efter förolämpning 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Den monoklonala antikroppar (15.3B9, PAX7) som utvecklats av (J. Dodd, TM Jessell och A. Kawakami) erhölls från utvecklingsstudier Hybridoma Bank utvecklats under ledning av NICHD underhålls och av University of Iowa, Institutionen för bio-vetenskaper , Iowa. DP är mottagare av Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1 från National Institute on Drug Abuse. Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH4 (16 hr) | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Marsh Automatic Incubator | Other | Lyon | RX | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to cut embryo from surrounding membranes following fixation |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 30% H2O2 | Reagent | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| BSA | Reagent | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| NGS | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Primary Antibodies | Reagent | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4G11, 15.3B9, PAX7 | For these antibodies, investgators used mouse donnors |
| Peroxidase conjugated-Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride | Reagent | Pierce, Thermo Scientific | 34001 | Store at -20; Allow bottle to warm to RT before use. |
| Cedar wood oil | Reagent | Sigma-Aldrich | W522503 | |
| Fast green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 |
References
- Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord. Cell. 64, 635-647 (1991).
- Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation. Development. 121, 813-824 (1995).
- Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
