从美国的马蹄蟹，鲎波吕斐摩斯采血车

Summary

美国鲎，鲎波吕斐摩斯，无疑是最方便的任何无脊椎动物的血液大量源。血液成分简单，只有一个循环，颗粒amebocyte，只有三个蛋白质丰富的血浆，血蓝蛋白，C -反应蛋白和α2-巨球蛋白的细胞类型。发自内心的血液收集和离心分离血细胞和血浆。

Abstract

鲎的任何最佳的长寿命无脊椎动物的免疫系统。马蹄蟹的免疫研究提供了便利，便于收集大量的血液，并从简单的血液。马蹄蟹只有在一般的流通，颗粒amebocyte一个单一的细胞类型。血浆海水中的盐含量，只有三个丰富的蛋白质，血蓝蛋白，呼吸蛋白，C -反应蛋白，在外来细胞的杀伤破坏的功能，包括细菌细胞和α2-巨球蛋白，能抑制蛋白酶入侵的病原体。血液收集的条件下，心脏穿刺直接脂多糖（又名，内毒素，LPS），革兰氏阴性菌的产品，最大限度地减少污染。大型动物可以产生200 - 400毫升的血液。等离子体的研究，立即清除血细胞从血浆离心的血浆，然后可以分割成它的组成蛋白质。方便的血细胞是研究微观LPS无等渗盐水（0.5 M氯化钠）的条件下，允许直接镜检培养皿的表面上放置一个多脂多糖免费coverglasses通过收集小体积血，然后安装这些coverglasses在简单的观察室，下面的细胞附着。一个直接观察的第二准备，以收集3 - 5毫升血液，在LPS无胚盘，然后explanting片段的聚合amebocytes一腔三明治组织之间的幻灯片和一个玻璃罩。在这个准备，运动型amebocytes迁移到盖玻片表面，在那里他们可以很容易地观察到。凝血系统涉及amebocytes聚集和形成血块，这是由血细胞分泌颗粒释放的一种蛋白质，coagulin外。洗血细胞的生化分析的需要，聚集和脱颗粒不会发生，它可以通过收集到0.1 2％的Tween - 20，0.5 M的LPS无盐，其次是细胞离心和洗涤用0.5的中号的卷的血液完成氯化钠。

Protocol

鲎有关的出血的解剖特点（图1）

图1

1. 人体的三个主要业务部门，由前到后，prosoma（P）opisthosoma（海外），和尾节^（T）1。
2. prosoma前和横向的自由空间的法兰。
3. opisthosoma后最压痕，尾节阐述，是终端湾。
4. 联合prosoma的opisthosoma口齿铰链（H）。
5. 心脏是位于沿背中线，下方的甲壳prostoma和opisthosoma ^2（图2）。
   
   
   
   
   图2
   
   

总的考虑，不育和保护暴露于脂多糖（内毒素）

1. 成功出血的主要敌人是细胞聚集，胞外分泌，coagulin血块的形成。细胞聚集和胞外分泌刺激脂多糖（又名，内毒素，LPS），革兰氏阴性菌的产物。洗涤细胞胞吐的LPS的阈浓度为0.1 - 1毫克/毫升，但悬浮在血浆中的细胞被激活显^着降低浓度3。内毒素是由简单的高压灭菌不灭活，可以被假定为在表面上，并在解决方案和未认证的内毒素试剂。
2. 为了减少在收集血液凝血的机会，选择只有完美的，完好的动物出血。预冷却在4 ° C室温1-2 h的动物。实践无菌技术。避免与内毒素污染。
3. LPS无3％的盐水在中医临床中使用，可以从医疗供应商购买（见专门的试剂和耗材表）。 LPS的潜伏期可去除玻璃器皿和金属在180 ° C，4小时。无菌一次性使用的注射器针头式的Petri培养皿，和螺丝帽的离心管都脂多糖，可以不修改，只要实行适当的无菌技术是使用。
4. 不同动物的血细胞的稳定性不同，与一些动物个体进行自发脱粒的细胞，导致coagulin血块的形成，即使动物是最大的照顾流血。其他个人鲎血细胞明显更稳定，并遵循适当的程序时，仍然在出血和细胞从血浆中分离完全颗粒状。
5. 据报道，几家代理商稳定的血细胞，下面的出血，包括咖啡因（脂多糖3％氯化钠为0.25卷为10 mM咖啡因流血^）4，普萘洛尔（终浓度为1毫米^）5 6，二甲基亚砜，二价阳离子螯合（葡萄糖为0.1米，0.03米的柠檬酸钠，柠檬酸0.026中号10毫米二钠乙二胺四乙酸（钠₂ EDTA）的，pH值^4.6）7，G蛋白和磷脂酶- C的途径的抑制剂（霍乱和同等体积的渗入百日咳毒素^{，U73122）8，}氯替代磺酸钠阴离子^9，氯离子通道阻滞剂^9，9环腺苷拮抗剂，巯基试剂（5毫米N -乙基马来酰亚胺^{，NEM）5，}和膜活性清洁剂吐温20（渗入到0.1卷2％Tween - 20的LPS无0.5 M氯化钠）。

用品和出血鲎试剂：收集大量的血液

1. 一个或多个大，完好的马蹄蟹
2. 喷瓶含70％乙醇
3. Kimwipes
4. 14号针
5. 坚固镊子
6. 用冰块的冰桶
7. 50毫升的螺丝帽塑料一次性离心管
8. 机架容纳50 mL管
9. 反离心机
10. 无菌50毫升血清移液器
11. 灯泡贯流式吸液管填料
12. 一次性使用无菌过滤设备
13. 真空泵
14. LPS免3％NaCl溶液（血细胞的集合）
15. 吐温20（血细胞的集合）

大批量出血的筹备工作

1. 出血，使用大型的，完好的动物。冷藏冷房前出血1小时的动物。
2. 建立一个稳定的支持与冰桶，高约0.3米（邮寄冷水或冷冻试剂，一次性泡沫塑料海运集装箱适当）和经营者的低椅子的舒适安排。冰桶放在支撑结构和绘制椅子到本机。你应该在你的胳膊肘你的大腿上休息的椅子上长时间舒适的客厅，并用左手拿着一个苦苦挣扎的鲎血液收集管在冰桶冰床直立撑起以上定位。
3. 前寒意4 - 6螺丝封在冰浴50毫升的一次性塑料离心管。直立管周围的冰浴容器的周边范围的冰。前开始出血操作，删除从管和相邻的表格盖瓶盖，坚持无菌技术。
4. 删除第一个14 GA针和使用坚固镊子松开针在其袖子，但不删除针从袖子。保持无菌。切勿用手指触摸进针的任何部分。针针裸露的屁股与相邻的柜台上放置与套筒接触任何表面，以保持其不育性升高。
5. 一块与70％的乙醇Kimwipe。

出血的动物（特别是右手操作）

1. 动物出血：prosoma前法兰和抓基地的尾巴（终端湾）的opisthosma后部分拇指接触的四个手指在左手抓住动物。腹面的动物面临的手掌。尾节在于沿在手腕的拇指和项目的基础。 Flex的动物轻轻prosoma和opisthosoma直角（图3a）。
   
   
   
   图3
   
   
2. 清洁外露的铰链关节连接prosoma用70％乙醇和opisthosoma应用乙醇蘸Kimwipe（图3b）。
3. 旋转的左手手指2 - 4至上，动物的背表面朝上。用右手，插入注射器针头14 GA，仍然在其保护套，左手手指2和3之间。拿镊子的右手，并删除其保护套针抓钳（图3c）的对接。左手旋转，使手的背水面面对你的左边，拇指和食指，和动物是其面临的右手背表面倒挂。定位于50 ml收集管和东方的动物，使针的尖底是在铰链关节，使针轴是平行的背中线（图3d）指出以上的屁股针。通过铰接插入针的尖底，入心腔，保持背中线平行针定位，并在中线与对接仍高于开放收集管定位针插入。针插入约1 - 2厘米深的prosoma的核心部分。只要心脏被刺破，血液会流向迅速（图4a，箭头），所以重要的是要确保注射器针头结束分娩是在收集管口的位置，收集的血液的初始浪涌。
4. 血液会退出的心，最初在一个连续的流，后约30 - 50毫升血液已收集，将放缓至个别滴（图4b）。为了改善血液流动，它可能是好的政策，重新定位针略尖。针倾斜向上或向左或向右滑动其尖端深入入心，或拉铰接找到位置，优化血液流动。不要过度压缩的动物，损害动物，因为这个风险，可能会造成淤血启动凝血。
   
   
   
   图4
   
   
5. 由于每个收集管与血液填充，旋转冰浴，使未来的空管，下针的结束分娩。
6. 如出血减慢，运行在逆行方向进针，入心有空气流动的风险。可能发生这种情况时，动物理顺，从而降低血压。尽量避免动物保持在弯曲的位置，或允许整顿仅出现缓慢。
7. 当动物捐血站，删除从心针出血。重新收集管帽，并立即离心机表离心机，1000转，5分钟。血细胞会形成紧凑颗粒的收集管底部。由于凝血的所有组件内的血细胞分泌囊泡中，尽快血浆是从细胞分离，血浆凝血的风险被淘汰。
8. 这是必须避免凝血瘀血。采取以下措施减少凝血的风险：预冷的动物，并保持在冰浴的收集管;柔和处理的动物;减少血液流动的速度与注射器针头，血液离心立即经过收集，避免污染的针头和收集管内毒素;维持无菌程序。正如上面所提到的的，一些动物个体，尤其是烦躁的血细胞，启动胞外分泌，即使采取了这些预防措施是其次。
9. 离心后，检查血液凝固的迹象管 - 细胞和凝胶状血块材料链连接管的墙壁，血块顶部的凝胶状物质，或者更糟的是，大量的血块包埋在血细胞液柱（图4c，箭头）。从这些管子的材料是血清，血浆，并含有血细胞分泌的产品。
10. 血浆转移到无菌试管中，用50 mL无菌血清吸管。移液时要小心，以避免吸细胞沉淀在试管底部的细胞。最好是离开以上的颗粒几毫升的血浆，以避免干扰细胞沉淀。
11. 上述步骤的目的是收集大量的血细胞分泌的产品未受污染的血浆卷。要收集大量的洗血细胞，血液收集到0.1 2％Tween - 20的LPS无3％NaCl溶液中溶解的卷。离心10分钟，轻轻的细胞，建立一个松散的细胞沉淀，然后用脂多糖3％氯化钠的几个变化的细胞。可以编写包含的血细胞的分泌产物的细胞提取LPS无蒸馏水洗涤细胞裂解。这裂解包含丰富的蛋白质和多肽的抗微生物免疫防御^10,11，还含有coagulogen，酶原形式存在的结构蛋白外血块，并收集蛋白酶转换coagulogen到coagulin ，形成蛋白聚合成纤维血块^12。这种提取物是类似市售的产品，amebocyte裂解或鲎鲎，这是用于检测存在^脂多糖 13 。负责coagulogen水解修改coagulin蛋白酶级联反应被激活由^LPS 14 。
12. 动物的处置后出血。出血上述方法进行动物耐受性好。在伍兹霍尔海洋生物实验室工作时，我返回后出血与期望，他们将生存的海洋动物。如果动物是从遥远的马蹄蟹的正常范围保持在水族箱，他们可以流血反复每月一次或两次。正如下文所述，维持在圈养的动物都需要高品质的水，并经常摄食，以保持他们的健康。安乐死可以通过破坏背侧神经节，这是坐落在两眼之间的背中线。

等离子处理和存储

1. 从蛋白酶的保护。如果血浆用于蛋白质纯化，它应与蛋白酶抑制剂治疗后，立即集合。加入phenylmethylsulfonylfluoride（PMSF）终浓度为1毫米。 PMSF保持为0.1 M的股票在DMSO或乙醇溶液。这是很不稳定的^水 15，因此不能依靠持久的保护，但除了将灭活后立即分离血浆，血细胞可能已经从细胞中释放的蛋白酶的小批量。
2. 无菌过滤：超滤下使用一次性介质过滤装置，装有0.22毫米的孔隙​​过滤器真空等离子体消毒。这些过滤器堵塞的倾向。离心过滤，以减少这个问题之前，最好是等离子。如果大量的血浆处理，这是明智的预过滤血浆首先使用1毫米孔径一个微孔过滤器，然后用0.45毫米孔径微孔过滤。
3. Plasma可以得到保护，免受细菌污染加入NaN的₃至终浓度为0.2毫克/毫升，或无菌过滤。未消毒的血浆不应该超过2天，期间无一或正在采取的这些抗菌措施的其他存储。
4. 血液凝固。与哺乳动物的凝血系统，鲎血浆中含有凝血元素没有。相反，整个机械凝块的形成，血块的结构蛋白（coagulogen）和蛋白酶系统的过程coagulogen以使其能够聚合成不溶性凝块的，是发现^在 16的血细胞的分泌颗粒。因此，如果被删除之前，他们有机会进行胞吐的血细胞，血浆凝血蛋白质是完全免费和将无限期地保持液体。
5. 蛋白质纯化。血蓝蛋白是目前在40毫克/毫升血浆中，是一个70 kDa的亚基48 MER。它可以隔离超速离心（40,000 X克，8小时），具有较大的孔隙大小，如排除^BioGel A5m 17树脂或凝胶过滤。 C -反应蛋白存在于1 - 5毫克/毫升，并用钙^螯合剂 18洗脱可以隔离phosphorylethanolamine琼脂糖亲和隔离。广谱蛋白酶抑制剂_，2 macroglogulin，已纯化Sephacryl S - 300型树脂后血蓝蛋白和C -反应蛋白已被删除¹⁹凝胶过滤。

文化运动型血细胞镜检

1. amebocyte草坪，在体外建立：LPS无3％NaCl溶液中添加无菌塑料的Petri式培养皿为35毫米的菜，为60毫米的菜2.5毫升，6毫升90毫升菜（1毫升）。血液是由心脏穿刺，使用上面介绍的方法获得，但与修改了23号，在无菌注射器针头1，而不是用14号针头。血液流动下拉下降，从23号针头收集到35毫米盘，3到60毫米盘滴，和100毫米盘9成滴1滴。血细胞，然后温柔纷飞，首先在一个圆形图案，然后再返回，来回在3％NaCl溶液混合均匀。准备5分钟，在室温T孵育使血细胞附着到培养皿的表面，然后选择³缓冲区最初的生理盐水取代。
2. 如果想要保持​​在一个undegranulated条件下的底层连接的血细胞，取代最初的生理盐水血浆混合新鲜脂多糖免费的3％氯化钠。等离子加速，甚至没有在LPS的自发的血细胞脱颗粒，其去除，稳定细胞undegranulated状态。
3. 如果最初的生理盐水取代用无菌血浆，血细胞转化的循环血细胞（图5）卵形的形状和扁平到基质，然后启动脱粒和一层coagulin外血块的形成以上夷为平地amebocytes的^草坪 20 。
   
   
   
   图5
   
   
4. 建立汇总amebocytes植文化。当血液收集无菌，无脂多糖条件下，血细胞落户暂停和聚合，形成一个组织样肿块。一个方便的容器是玻璃胚盘呈现在^{180 0℃}孵育4小时的LPS无使用19号针头穿刺心脏的血液收集在这个容器中的孵育1 - 在室温T，然后用18号无菌注射器针头amebocyte总量削减1平方毫米的片2小时，夹在两coverglasses或玻璃罩和幻灯片coverglasses碎片分离出来，作为垫片。约半小时后，amebocytes开始从外植体的外围迁移到盖玻片（图6A），在那里他们可以观看相衬^或 21 DIC的光学。起初，细胞迁移是透明伪足（图6b（M））以上的移民底层扩展紧凑，和，然后降低接触表面和提出的议案涉及的颗粒状细胞质流动到伪足²² 。后来，细胞扁平化（图6B（F）），并开始脱颗粒（图6b（D）），并停止^运动 23 。这里所描述的文化室，让不同的实验药物灌注到文化室，以探讨其对细胞运动和颗粒^胞吐9的影响。延长amebocyte文化的方法论审查镜检可以发现^在 24 。
   
   
   
   图6
   
   

成年马蹄蟹在水族箱维护

马蹄蟹需要高品质的海水，可保持在装有水净化系统，可提供微粒过滤，曝气，脱硝^水 25的水族箱。虾，龙虾，鱼，鱿鱼或动物应该是吃一个星期2或3倍。进料是通过去除动物的水族馆，解放军清在它的后面，并放在嘴里的食物。如果饿了，动物不久将开始吞咽食物。根据海水系统的复杂程度，动物应保持一个小时左右，直到它排粪在海水中的一个单独的容器或已经开始喂养后，它可以返回到水族馆。长期维护，动物应保持远离光线，以防止甲壳表面绿色或蓝绿色藻类的生长。藻类侵蚀的甲壳和自成年不蜕皮，这将导致死亡的动物^26。在野生动物部分埋在沙的时间花费不多，但在水族箱中的沙或碎石呈现在保持长期维护的清洁水平的重要的难度。

Discussion

有4种鲎， 鲎波吕斐摩斯从北美东海岸和三个品种，范围从日本到孟加 ​​拉湾。动物被确定为“活化石”，因为解剖学上的类似形式已为化石发现^4.45亿年前27。鲎代表一个长寿命的动物，需要10 - 13岁达到成熟和生活至少20年^的 28 。虽然一直受到广泛的收获作为诱饵的鳗鱼，海螺渔业^29，美国的鲎仍然相当丰富，并允许50毫升血从一个小的成人非破坏性的收集和，从高达400毫升大的女性。即使这多少血的收集，在不到10分钟就可以完成。据我所知，没有其他现成的无脊椎动物，给予了这么多血，这么少的努力。

内毒素的鲎试验的重要性，对革兰氏阴性菌的存在的一个指标，刺激免疫^系统的鲎13的兴趣。鲎试验取决于由LPS ¹⁴日的血液凝血系统的启动蛋白酶激活，一个读出血凝块形成一种蛋白酶活性比色法。免疫力已收到的最大关注的两个元素已被血浆蛋白的几种蛋白质和肽的血细胞分泌颗粒。结果已在海拔鲎有任何长寿命无脊椎动物¹¹的最好的描述免疫系统的状态