Blutentnahme aus der amerikanischen Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

Summary

Der amerikanische Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus, ist wohl die günstigste Quelle für große Mengen von Blut aller Wirbellosen. Das Blut ist einfach in der Komposition, mit nur einem Zelltyp in der allgemeinen Zirkulation, die körnige Amöbocyten, und nur drei vorkommenden Proteine ​​im Plasma, Hämocyanin, das C-reaktive Proteine ​​und α2-Makroglobulin. Das Blut wird vom Herzen gesammelt und die Blutzellen und Plasma durch Zentrifugation abgetrennt.

Abstract

Die Pfeilschwanzkrebses hat die besten charakterisierten Immunsystems von langlebigen Wirbellosen. Das Studium der Immunität in Pfeilschwanzkrebse hat durch die Leichtigkeit in das Sammeln großer Mengen von Blut und von der Einfachheit des Blutes erleichtert. Pfeilschwanzkrebse zeigen nur einem Zelltyp in der allgemeinen Zirkulation, die körnige Amöbocyten. Das Plasma ist der Salzgehalt des Meerwassers und nur drei vorkommenden Proteine, Hämocyanin, das Atmungssystem Protein, das C-reaktive Proteine, die in der cytolytischen Zerstörung der fremden Zellen-Funktion, einschließlich Bakterienzellen und α2-Makroglobulin, das hemmt die Proteasen von eindringenden Krankheitserregern. Blut ist durch direkte Herzpunktion unter Bedingungen, die Kontamination durch Lipopolysaccharid (aka, Endotoxin, LPS), ein Produkt der Gram-negativen Bakterien zu minimieren gesammelt. Ein großes Tier Ertrag von 200 bis 400 ml Blut. Für die Studie des Plasmas werden Blutzellen sofort aus dem Plasma durch Zentrifugation entfernt und das Plasma kann dann fraktioniert werden in ihre Bestandteile Proteine. Die Blutzellen werden bequem mikroskopisch durch das Sammeln von kleinen Mengen von Blut in LPS-freien isotonischer Kochsalzlösung (0,5 M NaCl) unter Bedingungen, die direkte mikroskopische Untersuchung ermöglichen, indem eine oder mehrere LPS-freien Deckgläsern auf der Kulturschale Oberfläche untersucht, dann die Montage Deckgläsern in einfachen Beobachtung Kammern folgende Zelladhäsion. Ein zweiter Vorbereitung für die direkte Beobachtung ist auf 3 zu sammeln - 5 ml Blut in einem LPS-freien Embryo Gericht und dann Explantation Fragmente von aggregierten amebocytes zu einer Kammer, die Sandwiches das Gewebe zwischen einer Rutsche und einer Deckglas. In dieser Vorbereitung, die beweglichen amebocytes auf das Deckglas Oberfläche, wo sie leicht beobachtet werden können migrieren. Die Blutgerinnung System umfasst die Aggregation von amebocytes und die Bildung einer extrazellulären Blutgerinnsel eines Proteins, coagulin, die aus den sekretorischen Granula der Blutzellen freigesetzt wird. Biochemische Analyse der gewaschenen Blutkörperchen setzt voraus, dass die Aggregation und Degranulation nicht auftreten, die durch das Sammeln von Blut in 0,1 Volumen von 2% Tween-20, 0,5 M LPS-freien NaCl, gefolgt von einer Zentrifugation der Zellen und Waschen mit 0,5 M erreicht werden kann NaCl.

Protocol

Anatomische Merkmale des Pfeilschwanzkrebses relevanten Blutungen (Abb. 1)

Abbildung 1

1. Die drei großen Bereiche des Körpers, von vorne nach hinten, sind das Prosoma (P), die Opisthosoma (O), und das Telson (T) ^1.
2. Die vorderen und seitlichen freien Rande des Prosoma ist der Flansch.
3. Die hintere weitesten Einzug des Opisthosoma, wo die telson artikuliert, ist das Terminal Bucht.
4. Die gemeinsame, wo die Prosoma und Opisthosoma artikulieren ist das Scharnier (H).
5. Das Herz ist entlang der dorsalen Mittellinie entfernt, direkt unterhalb des Panzers von Prostoma und Opisthosoma ² (Abb. 2).
   
   
   
   
   Abbildung 2
   
   

Allgemeine Überlegungen, Sterilität und Schutz vor der Exposition gegenüber Lipopolysaccharid (Endotoxin)

1. Der größte Feind der erfolgreichen bluten wird Zelle Verklumpung, Exozytose und Bildung der coagulin gerinnen. Zellaggregation und Exozytose durch Lipopolysaccharid (aka, Endotoxin, LPS), ein Produkt der Gram-negativer Bakterien stimuliert. Die Schwellenkonzentration von LPS für Exozytose für gewaschenen Zellen ist 0,1 bis 1 mg / mL, sondern Zellen im Plasma suspendiert sind durch deutlich niedrigere Konzentrationen ³ aktiviert. Endotoxin ist nicht durch einfache Autoklavieren inaktiviert und kann davon ausgegangen werden anwesend sein auf Oberflächen und in Lösungen und Reagenzien, die nicht zertifiziert sind, werden Endotoxin-frei.
2. Um die Chancen der Gerinnung bei der Entnahme von Blut, wählen Sie nur einwandfreie, unbeschädigte Tiere für Blutungen. Pre-chill die Tiere 1-2 h in den 4 ° C Raum. Praxis steriler Technik. Vermeiden Sie Verunreinigungen mit Endotoxin.
3. LPS-frei 3% ige Kochsalzlösung wird in der klinischen Medizin verwendet und kann von medizinischen Anbietern bezogen werden (siehe Tabelle der spezialisierten Reagenzien und Betriebsstoffe). LPS aus Glas und Metall durch Inkubation bei 180 ° C für 4 Stunden entfernt. Sterile Einweg-Spritzen-Nadeln, Petri-style Kulturschalen und Schraubverschluss Röhrchen sind alle LPS-frei und können ohne Änderungen so lange wie richtige sterile Technik praktiziert werden.
4. Die Stabilität der Blutkörperchen verschiedener Tiere unterscheidet, mit den Zellen des einzelne Tiere, die spontane Degranulation, was in der Bildung der coagulin Blutgerinnsel, auch wenn das Tier ausgeblutet mit größter Sorgfalt. Die Blutzellen von anderen einzelnen Pfeilschwanzkrebse sind wesentlich stabiler, und wenn richtige Verfahren eingehalten werden, bleiben voll Granulat während der Blutung und der Trennung von Zellen aus dem Plasma.
5. Mehrere Agenten wurde berichtet, dass die Blutkörperchen nach Blutungen, einschließlich Koffein (bluten in 0,25 Volumen von 10 mM Koffein in LPS-frei 3% NaCl) ^4, Propranolol (1 mM Endkonzentration) ^5, Dimethylsulfoxid ^6, zweiwertiges Kation Chelat-Stabilisierung ( bluten in ein gleiches Volumen von 0,1 M Dextrose, 0,03 M Natriumcitrat, 0,026 M Zitronensäure, 10 mM Dinatrium Ethylendiamintetraessigsäure (Na ₂ EDTA), pH 4,6) ^7, Inhibitoren des G-Protein-und Phospholipase-C Pathways (Cholera und pertussus Toxine, U73122) ^8, Substitution von Chlorid mit Isethionat Anion ^9, Chlorid-Kanal-Blocker ^9, zyklischen AMP-Antagonisten ^9, Sulfhydrylreagenzien (5 mM N-Ethyl-Maleimid, NEM) ⁵ und die Membran-wasch-Tween-20 ( bluten in 0,1 Volumen 2% Tween-20 in LPS-freien 0,5 M NaCl).

Verbrauchsmaterialien und Reagenzien für die Entlüftung des Pfeilschwanzkrebses: Sammlung von großen Mengen von Blut

1. einen oder mehrere große, unbeschädigt Pfeilschwanzkrebses
2. Spritzflasche mit 70% Ethanol
3. Kimwipes
4. 14-Gauge-Nadel
5. robuste Zange
6. Eiskübel mit Eis
7. 50 ml mit Schraubverschluss Kunststoff-Einweg-Zentrifugenröhrchen
8. Rack auf die 50 ml-Röhrchen halten
9. Counter-top-Zentrifuge
10. sterile 50-ml-serologischen Pipetten
11. Birne-Typ Pipettenfüller
12. Einweg-Sterilfilter Apparat
13. Vakuumpumpe
14. LPS-frei 3% NaCl-Lösung (für die Sammlung von Blutzellen)
15. Tween-20 (für die Sammlung von Blutzellen)

Die Vorbereitungen für großvolumige Blutungen

1. Für Blutungen, verwenden Sie große, unbeschädigt Tiere. Gefühlt das Tier für 1 h in einem kalten Raum vor Blutungen.
2. Stellen Sie eine komfortable Anordnung mit einer stabilen Unterstützung für einen Eiskübel, dass etwa 0,3 Meter hoch (die Einweg-Styropor-Verpackung auf Mailing-kalt oder gefroren Reagenzien geeignet ist) und einem niedrigen Stuhl für den Bediener. Der Eiseimer ist an der Tragstruktur angebracht und der Stuhl wird gezeichnetbis zu diesem Gerät. Sie sollten bequem sitzen für einen längeren Zeitraum in den Stuhl mit dem Ellbogen auf die Oberschenkel, und mit der linken Hand, die eine kämpft Pfeilschwanzkrebses über dem Blutentnahmeröhrchen aufrecht in einem Bett aus Eis in den Eiskübel gestützt positioniert.
3. Pre-chill 4 bis 6 der 50 ml-Einweg-Kunststoff-Röhrchen mit Schraubverschlüssen im Eisbad. Die Rohre werden senkrecht in das Eis um den Umfang des Eises Badbehälter reichten gesetzt. Kurz vor Beginn der Blutung Betrieb, entfernen Sie die Schutzkappen von den Rohren und Ort Kappen auf nebenstehende Tabelle, die Einhaltung steriler Technik.
4. Entfernen Sie den Deckel eines 14 ga Nadel und die robuste Zange, um die Nadel in ihre Hülle zu lösen, aber nicht entfernen Nadel aus dem Ärmel. Der Aufrechterhaltung der Sterilität. DO NOT TOUCH ANY Teil der Nadel mit den Fingern. Legen Hülse mit Nadel auf einer benachbarten Zähler mit der exponierten Hintern der Nadel erhöhte vor dem Kontakt mit einer Oberfläche, um ihre Sterilität zu erhalten.
5. Befeuchten Sie ein Kimwipe mit 70% Ethanol.

Entlüften des Tieres (speziell für den Rechtshänder Operator)

1. Halten Sie das Tier für Blutungen: grasp Tier in der linken Hand mit vier Fingern in Kontakt mit dem vorderen Flansch des Prosoma und dem Daumen greifen das hintere Teil des opisthosma an der Basis des Schwanzes (Terminal bay). Die Bauchseite des Tieres steht vor der Handfläche. Die telson liegt an der Basis des Daumens und Projekte über das Handgelenk. Flex das Tier vorsichtig, so dass Prosoma und Opisthosoma im rechten Winkel zueinander (Abbildung 3a) sind.
   
   
   
   Abbildung 3
   
   
2. Reinigen Sie die exponierte Gelenk verbindet Prosoma und Opisthosoma mit 70% Ethanol aufgetragen mit einem Ethanol-angefeuchtet Kimwipe (Abbildung 3b).
3. Drehen Sie die linke Hand, so dass die Finger 2 bis 4 obersten und der dorsalen Oberfläche des Tieres stellt sich sind. Mit der rechten Hand, legen den 14 ga Spritzennadel, noch in seiner Schutzhülle, zwischen den Fingern 2 und 3 der linken Hand. Nehmen Sie die Pinzette in der rechten Hand und entfernen Sie die Nadel aus der Schutzhülle durch Ergreifen des Po mit der Pinzette (Abbildung 3c). Drehen Sie die linke Hand, so dass dorsalen Fläche der Hand Gesichter auf der linken Seite, mit Daumen und Zeigefinger sind oben, und das Tier auf dem Kopf steht, mit seinem Rücken zugewandte Fläche der rechten Hand. Positionieren Sie den Kolben der Nadel über die erste der 50 mL-Röhrchen und orientieren das Tier so, dass das scharfe Ende der Nadel im Gelenk und damit die Nadel Welle parallel zur dorsalen Mittellinie (Abbildung 3d) ist spitz. Legen Sie das scharfe Ende der Nadel durch das Drehgelenk in das Lumen des Herzens, halten Sie die Nadel parallel zur dorsalen Mittellinie positioniert und eingefügt an der Mittellinie und mit dem Kolben der Nadel immer noch über die Eröffnung der Sammlung Rohr positioniert. 2 cm tief in den Teil des Herzens in der Prosoma - Die Nadel wird etwa 1 eingesetzt. Sobald das Herz durchbohrt ist, wird das Blut schneller fließen (Abb. 4a, Pfeil), so ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Lieferung Ende der Kanüle in den Mund des Sammelröhrchens positioniert ist, um die erste Welle von Blut zu sammeln.
4. Blut wird das Herz zunächst Ausfahrt in einem kontinuierlichen Strom, dass nach etwa 30 bis 50 ml Blut gesammelt wurden, um einzelne Tropfen (Abbildung 4b) langsam wird. Zur Verbesserung der Durchblutung, kann es eine gute Politik zu re-orientieren die Spitze der Nadel leicht werden. Kippen Sie die Nadel nach oben oder unten, links oder rechts; schieben ihre Spitze noch tiefer in das Herz oder ziehen Sie es näher an die Gelenk, um die Position, die den Blutfluss optimiert zu finden. Nicht komprimieren das Tier übermäßig, weil diese Risiken Beschädigung des Tieres führen, dass das ausgetretene Blut zu initiieren Blutgerinnung.
   
   
   
   Abbildung 4
   
   
5. Da jedes Sammelrohr füllt sich mit Blut, drehen Sie das Eisbad auf die nächste leere Röhre unter der Auslieferung Ende der Nadel zu bringen.
6. Als Blutung verlangsamt, laufen Sie Gefahr, dass Luftstrom in retrograder Richtung in die Nadel ins Herz. Dies kann auftreten, wenn das Tier begradigt, wodurch der Blutdruck. Versuchen Sie dies durch die das Tier in die Beugestellung oder indem Begradigung nur langsam auftreten zu verhindern.
7. Wenn das Tier Blutspenden stoppt, entfernen Sie die Nadel Blutungen aus dem Herzen. Re-cap der Sammlung-und Zentrifugenröhrchen sofort in der Tischzentrifuge, 1000 rpm, 5 min. Die Blutzellen werden kompakte Pellets bei den Böden der Kollektion Röhren bilden. Da alle Komponenten für die Blutgerinnung in sekretorischen Vesikeln der Blutzellen enthalten sind, so bald wie Plasma von den Zellen getrennt,das Risiko der Gerinnung des Plasmas wird eliminiert.
8. Es ist unbedingt zu vermeiden Gerinnung des ausgetretenen Blutes. Folgende Maßnahmen verringern das Risiko von Blutgerinnseln: Pre-Kühlen des Tieres und die Aufrechterhaltung der Sammelröhrchen in einem Eisbad, schonende Behandlung des Tieres; Reduzierung der Geschwindigkeit, mit der das Blut strömt aus der Kanüle; Zentrifugation des Blutes sofort nach der Entnahme; Vermeidung der Kontamination von Nadeln und Sammelröhrchen mit Endotoxin; Aufrechterhaltung steriler Verfahren. Wie oben erwähnt wurde, wurden einzelne Tiere besonders reizbar Blutkörperchen, die Exozytose einleiten, auch wenn diese Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden.
9. Nach Zentrifugation, inspizieren die Rohre für die Zeichen der Blutgerinnung - Stränge von Zellen und gallertartige Klumpen Material an den Wänden der Röhre befestigt, gallertartige Masse an der Spitze des Gerinnsels, oder, schlimmer noch, große Mengen von Blutgerinnsel mit eingeschlossenen Blutzellen im Flüssigkeitssäule (Abbildung 4c, Pfeil). Das Material, aus diesen Rohren ist Serum, Plasma nicht, und enthält die abgesondert Produkte der Blutzellen.
10. Das Plasma zu sterilen Röhrchen mit 50 ml sterilen serologischen Pipette. Seien Sie vorsichtig beim Pipettieren zu vermeiden Absaugen einer der Zellen aus dem Zellpellet in den Boden des Röhrchens. Am besten ist es, ein paar ml Plasma über dem Pellet zu verlassen, um nicht zu stören das Zellpellet.
11. Das oben beschriebene Verfahren wurde entwickelt, um große Mengen von Plasma durch die sekretorische Produkte der Blutzellen unberührten sammeln. Zum Sammeln großer Mengen gewaschen Blutkörperchen, sammeln das Blut in 0,1 Volumina von 2% Tween-20 in 3% LPS-freien NaCl-Lösung gelöst. Zentrifugieren Sie die Zellen vorsichtig für 10 Minuten zu einem lockeren Zellpellet zu etablieren, dann waschen Sie die Zellen mit mehreren Änderungen der LPS-frei 3% NaCl. Ein Auszug aus den Zellen, die sekretorische Produkte der Blutkörperchen enthält, kann durch Lyse der gewaschenen Zellen in LPS-freies destilliertes Wasser hergestellt werden. Das Lysat enthält eine Vielfalt von Proteinen und Peptiden, die in anti-mikrobielle Immunabwehr ^10,11 bedienen und enthält auch Koagulogen, das Zymogen Form der Strukturprotein der extrazellulären Blutgerinnsel, und die Sammlung von Proteasen, die Koagulogen konvertieren coagulin, die Form des Proteins, die in den Fibrillen des Gerinnsels ¹² polymerisiert. Dieser Extrakt ist ähnlich wie die im Handel erhältliche Produkt, Limulus Amöbocyten Lysat oder LAL, die dem Test auf das Vorhandensein von Lipopolysaccharid ¹³ verwendet wird. Die Protease-Kaskade verantwortlich für die proteolytische Modifikation von Koagulogen zu coagulin wird durch LPS ¹⁴ aktiviert.
12. Disposition von Tieren nach Blutungen. Blutungen unter der Leitung von Methoden identifiziert oben ist gut mit dem Tier gut vertragen. Bei Arbeiten am Marine Biological Laboratory in Woods Hole, kehre ich Tiere in den Ozean nach Blutungen in der Erwartung, dass sie überleben wird. Wenn Tiere in Aquarien entfernt von der normalen Bereich der Pfeilschwanzkrebse eingehalten werden, können sie immer wieder entlüftet werden ein-oder zweimal im Monat. Wie unten beschrieben wird, benötigen Tiere in Gefangenschaft gehalten Wasser von hoher Qualität und häufiges Füttern, um ihre Gesundheit zu erhalten. Euthanasie durch die Zerstörung der dorsalen Ganglion, das in der dorsalen Mittellinie zwischen den Augen liegt bewerkstelligt werden.

Verarbeitung und Lagerung von Plasma-

1. Schutz vor Proteasen. Wird das Plasma für Proteinreinigung verwendet werden, sollte es mit Protease-Inhibitoren unmittelbar nach der Entnahme behandelt werden. Add Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) auf eine Endkonzentration von 1 mM. PMSF ist als eine 0,1 M Stammlösung in DMSO oder Ethanol aufbewahrt. Es ist sehr instabil in Wasser ^15, so kann nicht für einen dauerhaften Schutz geltend gemacht werden, sondern zusätzlich sofort nach der Trennung von Plasma aus dem Blut Zellen wird die kleine Mengen von Proteasen, die aus den Zellen freigesetzt wurden möglicherweise inaktivieren.
2. Sterilfiltration: sterilisieren das Plasma durch Ultrafiltration unter Vakuum mit einem Einweg-Medium-Filtration Gerät mit einem 0,22 mm Poren-Filter ausgestattet. Diese Filter haben eine Tendenz zu verstopfen. Es ist ratsam, um das Plasma vor der Filterung, um dieses Problem zu reduzieren Zentrifuge. Wenn große Mengen von Plasma verarbeitet werden, ist es ratsam, Vorfilter das Plasma zunächst mit einem Millipore-Filter mit einer 1 mm Porengröße, dann mit einer 0,45 mm Porengröße Millipore-Filter.
3. Plasma können durch bakterielle Kontamination geschützt entweder durch Zugabe von NaN ₃ zu einer endgültigen Konzentration von 0,2 mg / mL oder durch Sterilfiltration. Unsterile Plasma sollte nie für längere Zeit als 2 Tage ohne das eine oder andere dieser anti-bakterielle Maßnahmen ergriffen, gespeichert werden.
4. Blutgerinnung. Im Gegensatz zu den Säugetieren Gerinnungssystem, enthält die Limulus Plasma keines der Elemente für die Blutgerinnung. Stattdessen wird der gesamte Maschinen für die Bildung von Blutgerinnseln, die Strukturprotein des Gerinnsels (Koagulogen) und das System der Proteasen, die Prozess coagulogen um es zu polymerisieren vermag in die unlösliche Klumpen, ist in den sekretorischen Granula der Blutzellen ^{16 zu} finden. Also, wenn das Blut Zellen entfernt werden, bevor sie eine Chance, Exozytose unterziehen müssen, wird das Plasma völlig frei von den Proteinen für die Gerinnung und bleibt Flüssigkeit auf unbestimmte Zeit.
5. Proteinreinigung. Hemocyanin vorhanden ist bei 40 mg / mL in Plasma und ist ein 48-mer eines 70 kDa-Untereinheit. Es kann durch Ultrazentrifugation (40.000 X g, 8 h) oder Gelfiltration mit einer großen Porengröße Ausschluss Harz wie BioGel A5M ¹⁷ isolierten werden. Das C-reaktive Proteine ​​sind bei 1 präsentieren - 5 mg / mL und kann durch Affinität Isolation auf phosphorylethanolamine-Sepharose isoliert werden, mit Elution mit einem Calcium-Chelator ^18. Das Breitspektrum-Protease-Inhibitor, ein _{2-macroglogulin} hat durch Gelfiltration wurde auf Sephacryl gereinigt S-300 Harz nach Hämocyanin und das C-reaktive Proteine ​​wurden ¹⁹ entfernt.

Die mikroskopische Untersuchung der beweglichen Blutzellen in Kultur

1. Gründung der Amöbocyten Rasen in vitro: LPS-frei 3% NaCl-Lösung wird steril Kunststoff Petri-style Kulturschalen (1 mL einer 35 mm Schale, 2,5 ml für eine 60 mm Schale, 6 ml für eine 90 ml Schale) aufgenommen. Das Blut wird dann durch Herzpunktion mit dem oben beschriebenen Verfahren erhalten werden, jedoch mit der Änderung, dass eine 23 Gauge, 1 in sterilen Injektionsnadel wird anstelle des 14-Gauge-Nadel verwendet. Das Blut fließt Drop-by-Drop aus der 23-Gauge-Nadel und 1 Tropfen in das 35 mm Schale, 3 Tropfen in die 60 mm Schale, und 9 Tropfen in die 100 mm Schale gesammelt. Die Blutzellen werden dann einheitlich in der 3% NaCl-Lösung durch vorsichtiges Schwenken, zuerst in einem kreisförmigen Muster, dann hin-und her gemischt. Die Vorbereitung für 5 min bei Raumtemperatur T inkubiert, damit Blutkörperchen in die Schale anheften, dann die erste Kochsalzlösung wird mit einem Puffer der Wahl ³ ersetzt.
2. Wenn es erwünscht ist, das Substrat-attached Blutzellen in einem undegranulated Zustand zu erhalten, ist die anfängliche Kochsalzlösung Blutplasma Mischung mit frischen LPS-frei 3% NaCl ersetzt. Plasma beschleunigt die spontane Degranulation der Blutzellen auch in Abwesenheit von LPS und seine Entfernung stabilisiert die undegranulated Zustand der Zellen.
3. Wenn das erste Kochsalzlösung mit sterilem Plasma ersetzt wird, die Blutkörperchen aus dem eiförmigen der zirkulierenden Blutzellen (Abb. 5) zu transformieren und flach auf dem Untergrund, und dann starten Degranulation und die Bildung einer Schicht der coagulin extrazellulären Blutgerinnsel über den Rasen des abgeflachten amebocytes ^20.
   
   
   
   Abbildung 5
   
   
4. Gründung der Explantation Kulturen der aggregierten amebocytes. Wenn das Blut unter sterilen, LPS-freien Bedingungen gesammelt, setzen sich die Blutkörperchen aus Fahrwerk und aggregieren zu einem Gewebe-Masse zu bilden. Ein praktisches Behältnis für diese ist das Glas Embryo Gericht LPS-frei durch Inkubation für 4 h gerendert 180 ⁰ C. Blut in diesen Container durch Herzpunktion mit einer 19-Gauge-Nadel gesammelt wird für 1 inkubiert - 2 h bei Raumtemperatur T, dann Stück 1 mm ² aus dem Amöbocyten Aggregat mit einer sterilen 18-Gauge-Injektionsnadel geschnitten sind und zwischen zwei Deckgläsern oder ein Sandwich Deckglas und einer Rutsche von Fragmenten von Deckgläsern getrennt, um als Abstandshalter fungieren. Nach etwa einer halben Stunde beginnen amebocytes von der Peripherie der Explantation der Migration auf das Deckglas (Abb. 6a), wo sie mit Phasenkontrast oder DIC-Optik ²¹ gesehen werden kann. Zunächst werden die wandernden Zellen kompakt mit hyaline Pseudopodien (Abb. 6b (m)), die über die Migration Substrat erweitert werden, und dass dann in Kontakt mit der Oberfläche abgesenkt und Vorwärtsbewegung beinhaltet den Fluss des granularen Zytoplasma in den Pseudopodien ²² . Später, glätten die Zellen (Abb. 6b (f)) und initiieren Degranulation (Abb. 6b (d)) und aufhören Fortbewegung ^23. Die Kultur Kammer hier beschriebenen kann die Durchblutung der verschiedenen experimentellen Mittel in die Kultur Kammer auf ihre Auswirkungen auf die Zellbewegung und Granulat Exozytose ⁹ zu untersuchen. Eine erweiterte methodische Überprüfung der Amöbocyten Kultur für die mikroskopische Untersuchung kann in ²⁴ gefunden werden.
   
   
   
   Abbildung 6
   
   

Pflege von erwachsenen Pfeilschwanzkrebse in Aquarien

Pfeilschwanzkrebse erfordern eine hohe Qualität Meerwasser und kann in Aquarien mit einer Wasseraufbereitungsanlage, die Partikel-Filtration, Belüftung, und Denitrifikation des Wassers ²⁵ liefert ausgestattet beibehalten werden. Die Tiere sollten gefüttert 2 oder 3 mal pro Woche auf Garnelen, Hummer, Fisch oder Tintenfisch werden. Die Fütterung ist durch das Entfernen des Tieres aus dem Aquarium, pla erreichtCing es auf seinem Rücken, und Inverkehrbringen des Lebensmittels auf den Mund. Wenn Hunger, wird das Tier bald beginnen Schlucken der Speisen. Abhängig von der Komplexität des Meerwassers System, sollte das Tier für eine Stunde oder so gehalten werden, bis sie in einem separaten Behälter des Meerwassers Kot oder es kann auf das Aquarium zurückgegeben werden nach dem Füttern begonnen hat. Für die langfristige Wartung, sollte das Tier weg vom Licht gehalten werden, um das Wachstum von grünen oder blau-grüne Algen auf der Oberfläche des Panzers zu verhindern. Algen erodieren des Panzers und da die Erwachsenen nicht häuten, wird dies zum Tod des Tieres ²⁶ verursachen. In der Wildnis verbringen Tiere die meiste Zeit teilweise im Sand begraben, aber Sand oder Kies im Aquarium stellt eine Schwierigkeit bei der Aufrechterhaltung der Grad der Sauberkeit wichtig für die langfristige Wartung.

Discussion

Es gibt vier Arten von Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus von der Ostküste Nordamerikas und drei Arten, die von Japan in die Bucht von Bengalen. Das Tier wird als "lebendes Fossil" bezeichnet, weil anatomisch ähnlichen Formen, Fossilien aus 445.000.000 Jahre alt ²⁷ gefunden worden. Die Pfeilschwanzkrebses stellt ein langlebiges Tier, erfordert 10 bis 13 Jahren bis zur Fälligkeit zu erreichen und leben mindestens 20 Jahre ^28. Obwohl es umfangreiche Ernte als Köder für den Aal und Muschel Fischerei ²⁹ unterzogen worden sind, wird die amerikanische Pfeilschwanzkrebses noch einigermaßen reichhaltig und erlaubt die zerstörungsfreie Sammlung von 50 ml Blut aus einer kleinen Erwachsenen und bis zu 400 mL einer große weibliche. Sammlung von selbst so viel Blut kann in weniger als 10 Minuten abgeschlossen sein. Ich kenne keinen anderen zur Verfügung stehenden Wirbellosen, dass so viel Blut mit so wenig Aufwand bietet.

Die Bedeutung der LAL-Test für Endotoxin, ein Indikator für die Anwesenheit von Gram-negativen Bakterien ist das Interesse an dem Immunsystem des Pfeilschwanzkrebses ¹³ angeregt. Der LAL-Test hängt von der Aktivierung des initiierenden Protease der Blutgerinnung durch LPS ^14, mit einer Lese-out der Gerinnselbildung oder einem kolorimetrischen Assay für Protease-Aktivität. Die beiden Elemente der Immunität, die die größte Aufmerksamkeit erhalten haben, die Proteine ​​des Plasmas und der verschiedenen Proteine ​​und Peptide der sekretorischen Granula der Blutzellen. Das Ergebnis ist die Höhe des Pfeilschwanzkrebses, um den Status mit den besten beschriebenen Immunsystem für die langlebigen wirbellosen ¹¹ wurde