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Biology

미국 호르세쇼 게, Limulus Polyphemus의 혈액 수집

Published: October 13, 2008 doi: 10.3791/958
Automatic Translation
1,2, 3
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Davis, 2Marine Biological Laboratory - MBL- woods hole, 3Department of Biological Sciences, Hunter College of CUNY

Summary

미국 말굽 게, Limulus polyphemus은 틀림없이 모든 무척추 동물의 혈액의 다량을 위해 가장 편리한 소스입니다. 혈액의 일반적인 순환, 세분화 amebocyte, 그리고 플라즈마, hemocyanin, C - 반응 단백질 및 α2 - macroglobulin에서 3 풍부한 단백질에 하나의 셀 유형, 구성의 간단하다. 혈액은 심장에서 수집되고 혈액 세포 및 플라즈마 원심 분리로 구분됩니다.

Abstract

말굽 게 어떤 긴 무척추 동물의 가장 특징 면역 체계가 있습니다. 말굽 게는에서 면역의 연구는 혈액의 대량 수집 용이성으로하고 혈액의 단순에서 촉진되었다. 말굽 게는 일반적인 순환, 세분화 amebocyte에서만 하나의 셀 유형을 보여줍니다. 플라즈마는 바닷물의 염분 성분을 가지고 있으며, 단지 세 풍부한 단백질, hemocyanin, 호흡기 단백질, C - 반응 박테리아 세포를 포함한 외부 세포의 cytolytic 파괴 기능 단백질, 및 α2 - macroglobulin은 프로 테아제를 억제하는 병원균을 침해니다. 혈액은 lipopolysaccharide (일명, 내독소, LPS), 그람 음성 세균의 제품으로 오염을 최소화 조건 하에서 직접 심장 주사에 의해 수집됩니다. 혈액 400 ML - 대형 동물은 200를 얻을 수 있습니다. 플라즈마의 연구, 혈액 세포는 즉시 원심 분리에 의해 혈장에서 제거되며 플라즈마 다음의 구성 단백질로 fractionated 수 있습니다. 혈액 세포가 편리하게 다음 그 coverglasses를 장착, 문화 접시 표면에 대한 자세한 중 하나 LPS 무료 coverglasses를 삽입하여 직접 현미경 검사를 허용 조건 LPS 무료 isotonic 호수 (0.5 M NaCl)에 혈액 작은 볼륨을 수집하여 미세 공부 아르 세포 부착 다음과 같은 간단한 관측 실 인치 직접 관찰을위한 두 번째 준비 3를 수집하는 것입니다 - LPS없는 배아 요리의 혈액 5 ML하고 다음 실로 총체적 amebocytes의 조각을 explanting하는 슬라이드와 coverglass 사이에 샌드위치가 조직. 이 준비에서 운동성이있는 amebocytes 그들이 쉽게 볼 수 있습니다 coverglass 표면에,에 마이 그 레이션. 혈액 응고 시스템 amebocytes의 집합과 혈액 세포의 분비 과립의에서 발표되는 단백질, coagulin의 세포외 응고의 형성을 포함한다. 세탁 혈액 세포의 생화 학적 분석 2퍼센트 트윈 - 20, 0.5 M LPS 무료 NaCl, 세포의 원심 분리에 의해 다음과 0.5로 세척 M의 0.1 볼륨으로 혈액을 수집하여 수행할 수 수 집합과 degranulation가 발생하지 않습니다을 필요로 NaCl.

Protocol

출혈과 관련된 말굽 게의 해부 학적 특징 (그림 1)

그림 1

그림 1

  1. 신체의 세 가지 주요 부문은 사후에 앞쪽에에서 prosoma (P), opisthosoma (O), 그리고 텔슨 (T) 1입니다.
  2. prosoma의 앞쪽에과 측면 무료 마진은 플랜지입니다.
  3. 텔슨은 articulates opisthosoma의 사후 - 대부분의 들여쓰기는, 터미널 베이입니다.
  4. prosoma과 opisthosoma가 명확 조인트 경첩 (H)입니다.
  5. 마음은 단지 prostoma 및 opisthosoma 2 (그림 2)의 등딱지 아래, 등의 정중선을 따라 위치하고 있습니다.


    그림 2

    그림 2

일반적인 고려 사항, 불임 및 lipopolysaccharide에 대한 노출로부터 보호 (내독소)

  1. 성공적인 출혈의 가장 큰 적이 세포 clumping, exocytosis, 그리고 coagulin의 응고의 형성이다. 세포 집합과 exocytosis는 lipopolysaccharide (일명, 내독소, LPS), 그람 음성 세균의 제품으로 자극하고 있습니다. 1 MG / ML하지만 플라즈마에 일시 중지 세포가 상당히 낮은 농도 3 활성화됩니다 - 세탁 전지 exocytosis에 대한 LPS의 한계 농도는 0.1이다. 내독소는 간단한 autoclaving에 의해 inactivated되지 않으며 표면에 존재로 간주 될 수 있으며, 솔루션 및 내독소 무료로 인증되지 않은 시약 인치
  2. 혈액 수집하는 동안 응고의 가능성을 줄이기 위해, 출혈에 대해서만 완벽하게, 손상되지 않은 동물을 선택합니다. 4 ° C 방에 동물 1-2 H에게 사전 진정해. 멸균 기술을 연습합니다. 내독소와 오염을 피한다.
  3. LPS - 무료로 3 % 식염수는 임상 의학에서 사용되며 (전문 시약 및 소모품의 표 참조) 의료 공급 업체에서 구입할 수 있습니다. LPS는 180 4 시간 동안 ° C에서 배양하여 유리와 금속에서 제거할 수 있습니다. 무균 단일 사용 주사기 바늘, 페트리 스타일 문화 요리, 나사 캡 원심 분리기 튜브는 LPS - 무료이며 긴 있도록 적절한 멸균 기술이 연습이므로 수정하지 않고 사용할 수 있습니다.
  4. 동물이 가장 큰주의 출혈이 경우에도 다른 동물의 혈액 세포의 안정성은 coagulin의 응고의 형성에 결과 자발적인 degranulation을받은 일부 개별 동물의 세포와 다릅니다. 타인 말굽 올려 혈액 세포가 적절한 절차를 준수하면, 플라즈마 세포 출혈과 분리하는 동안 완벽하게 세분화된 유지 훨씬 더 안정되고.
  5. 몇몇 요원들은 카페인 (LPS 무료 3% NaCl 10 MM의 카페인의 0.25 권에 출혈) 4, propranolol (1 MM 최종 농도) 5, dimethylsulfoxide 6, 이가의 양이온 chelation (를 포함하여 출혈이 다음과 같은 혈액 세포를 안정화보고되었습니다 0.1 M 덱스 트로 오스, 0.03 M 나트륨 구연 산염, 0.026 M 구연산 초산, 10 MM 나트륨 ethylenediaminetetraacetic 산성 (나 2 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 산도 4.6) 7, G - 단백질과 포스 포 라이 페이스 - C 경로의 억제제 (콜레라과 동일한 볼륨에 출혈 pertussus의 독소, U73122) 8, isethionate 음이온 9, 염화물 채널 차단제 9, 순환 - 앰프 antagonists 9 sulfhydryl 시약 (5 MM N - 에틸 maleimide, NEM) 5, 멤브레인 - 활성 세제 트윈 - 20과 염화물의 치환 ( 0.1 볼륨 2퍼센트 LPS 무료 0.5 M NaCl에서 트윈 - 20)에 출혈.

말굽 게를 출혈에 대한 공급 및 시약 : 혈액의 대량 수집

  1. 하나 이상의 대규모 피해가 말굽 게
  2. 70 % 에탄올을 포함하는 애송이 병
  3. Kimwipes
  4. 14 게이지 바늘
  5. 질긴 포셉
  6. 얼음 얼음 양동이
  7. 50 ML 나사 캡 플라스틱 일회용 원심 분리기 튜브
  8. 50 ML 튜브를 잡아 랙
  9. 카운터 상단 원심 분리기
  10. 무균 50 ML serological pipettes
  11. 전구 형 피펫 필러
  12. 일회용 멸균 필터 장치
  13. 배기기
  14. LPS 무료 3퍼센트 NaCl 용액 (혈액 세포를 수집)
  15. 트윈 - 20 (혈액 세포를 수집)

대규모 출혈에 대한 준비

  1. 출혈의 경우, 대형, 손상되지 않은 동물을 사용합니다. 출혈 전에 추운 방에 1 H 위해 동물을 죽일거야.
  2. 약 0.3 미터 높이 (감기나 냉동 시약을 우편위한 일회용 스티로폼 운송 컨테이너가 적절한)와 연산자에 대한 낮은 의자는 얼음 양동이에 대한 안정적인 지원 편안한 배열을 설정합니다. 얼음 통은 지원 구조에 위치하고 의자를 그려있다최대이 단위 수 있습니다. 당신의 팔꿈치가 허벅지에 휴식과 함께 의자에 오랜 기간 동안 편안하게 앉아있을, 그리고 얼음 양동이에 얼음 침대에서 똑바로 누워 혈액 수집 튜브 위에 위치 가난한 말굽 게를 잡고 왼손으로. 있어야
  3. 사전 감기 4-6 얼음 욕조에서 스크류 폐쇄와 함께 50 ML 일회용 플라스틱 원심 분리기 튜브의. 튜브는 얼음 목욕 컨테이너의 주위에 원거리 얼음에 직립 설정되어 있습니다. 그냥 출혈 작업을 시작하기 전에, 멸균 기술을 준수하는, 인접 테이블에 튜브와 장소 모자에서 마개를 제거합니다.
  4. 14 가역 바늘의 뚜껑을 제거하고 소매에서 바늘을 느슨하게하기 위해 튼튼한 집게를 사용하지만 소매에서 바늘을 제거하지 마십시오. 불임을 유지합니다. 손가락으로 바늘의 어떤 부분을 만지지 마십시오. 바늘의 노출된 엉덩이 사이로 인접한 카운터에 바늘로 플레이스 슬리브는 불임을 유지하기 위해 모든 표면과 접촉에서 고가.
  5. 70 % 에탄올로 Kimwipe을 축축하게하다.

(특히 오른손 운영자) 동물 출혈

  1. prosoma의 앞쪽에 플랜지와 꼬리의 기지 (터미널 Bay)에서 opisthosma의 후부 부분을 쥐고 엄지손가락과 접촉 네 개의 손가락으로 왼쪽에있는 파악 동물 : 출혈에 대한 동물을 개최. 동물의 복부 표면은 손바닥을 얼굴. 텔슨은 손목을 통해 엄지와 프로젝트의 기본을 따라 자리잡고 있습니다. 부드럽게 너무 prosoma과 opisthosoma 하나의 다른 (그림 3A)에 직각되는 동물을 플렉스.

    그림 3

    그림 3

  2. 적용된 70 % 에탄올로 노출된 경첩 관절 연결 prosoma 및 opisthosoma를 청소 에탄올 moistened Kimwipe를 (그림 3B).
  3. 4 최고의과 동물의 등의 표면까지 얼굴 - 손가락이 그 같은 왼손을 회전합니다. 오른손으로, 왼손의 손가락 2와 3 사이에 여전히 보호 슬리브에 14 가역 주사 바늘을 삽입합니다. 오른쪽에있는 집게를 타고 포셉 (그림 3C)와 엉덩이를 쥐고하여 보호 소매에서 바늘을 제거합니다. 손을의 등의 표면은 왼쪽 엄지로 얼굴와 검지가 있으며, 동물이 오른쪽을 향하고는 등의 표면과 거꾸로되도록 왼쪽 회전. 바늘의 날카로운 끝이 바늘 축의 등 부분의 정중선 (그림 3D)에 평행이되도​​록 공동과 경첩을 가르키도록 50 ML 수집 튜브와 동양 동물의 첫번째 위에 바늘의 엉덩이를 놓습니다. 바늘이 등의 정중선에 평행하게 위치하고 정중선에서 아직도 모음 튜브의 구멍 위에 위치 바늘의 엉덩이 사이로 삽입 유지, 심장의 루멘에 힌지 공동 통해 바늘의 날카로운 끝부분을 삽입합니다. prosoma의 중심 부분에 깊이 2cm - 바늘은 약 1 삽입됩니다. 마자 마음이 구멍이므로, 혈액 (그림 4A, 화살표) 빠르게 흐름되므로 그것은 주사 바늘의 전달 끝은 혈액의 초기 서지를 수집하는 수집 관의 입을 통해 위치 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
  4. 혈액의 50 ML 수집되어 있고, 각각의 방울 (그림 4B)에 슬로우됩니다 - 혈액은 약 30 후 지속적인 스트림의 처음 마음을 종료합니다. 혈액 흐름을 개선하기 위해서는 약간 바늘의 다시 방향 끝에 좋은 정책을 수 있습니다. , 왼쪽 또는 오른쪽으로 바늘을 기울이기 또는 아래로, 마음으로 깊이의 팁을 슬라이드 또는 혈액 흐름을 최적화하는 위치를 찾기 위해 공동 경첩 가까이로 당겨. 이 위험은 동물을 손상하고 extravasated 혈액 응고 시작하는 원인이 될 수 있습니다 있기 때문에, 지나치게 동물을 압축하지 마십시오.

    그림 4

    그림 4

  5. 각 수집 관 피가 채웁니다 마찬가지로 바늘의 전달 끝 아래의 다음 빈 튜브를 가져 얼음 목욕을 돌린다.
  6. 출혈이 느려집으로, 당신은 바늘로 그리고 마음에 역행 방향으로 공기 흐름을 발생의 위험을 실행합니다. 동물이 밖으로 straightens 때함으로써 혈압을 감소 발생할 수 있습니다. 근육이 수축 위치에 동물을 유지하거나 서서히에만 발생하는 교정함으로써 이것을 억제하기 위하여 노력하고 있습니다.
  7. 동물이 피를주는 중지하면 심장에서 피를 바늘을 제거합니다. 다시 모자를 수집 튜브 및 테이블 상단 원심 분리기, 1000 RPM, 5 분 안에 바로 원심 분리기. 혈액 세포가 수집 튜브의 바닥에 소형 알약을 형성합니다. 응고 혈액의 구성 요소의 모든, 혈액 세포의 분비의 vesicles 내에 포함되어 있기 때문에 즉시 플라즈마로이 세포에서 분리합니다플라즈마 응고의 위험이 제거됩니다.
  8. 이것은 혈액의 응고 extravasated 피하기 위해 필수적입니다. 즉시 혈액의 원심 분리하고, 동물의 부드러운 핸들링,, 혈액이 주사 바늘 밖으로 흐르는있는 인텔리의 감소 사전 놀아요 동물과 얼음 욕조에서 수집 튜브를 유지하는 다음 조치는 혈액 응고의 위험을 줄일 수 이후에 수집, 내독소 바늘 및 수집 튜브의 오염의 방지, 살균 절차의 유지 보수. 상기되면서, 일부 개인 동물이주의 미행하는 경우도 exocytosis를 시작, 특히 과민성 혈액 세포 수 있습니다.
  9. 원심 분리 후, 응고 혈액의 흔적을위한 튜브를 검사 - 세포 및 젤라틴 응고 재료의 가닥은 튜브의 벽면에 응고 상단의 젤라틴 물질, 또는에 속은 혈액 세포와 응고의 악화, 대량 첨부 유체 칼럼 (그림 4C, 화살표). 이 튜브에서 소재 플라즈마, 혈청 아니며, 혈액 세포의 분비 제품을 포함하고 있습니다.
  10. 50 ML 멸균 serological 피펫과 멸균 튜브에 플라즈마를 전송합니다. 튜브의 바닥에있는 세포 펠렛의 세포 중 하나를 aspirating 않도록 pipetting시주의 운동. 세포 펠렛을 방해하지 않도록하기 위해 펠렛 위의 플라즈마 몇 ML두고하는 것이 좋습니다.
  11. 위에서 설명한 절차는 혈액 세포의 분비 제품에 의해 오염되지 플라즈마 대량를 수집하도록 설계되었습니다. 세탁 혈액 세포의 대량 데이터를 수집하는 3% LPS 무료 NaCl 용액에 녹아있는 2퍼센트 트윈 - 20의 0.1 볼륨에 혈액을 수집합니다. 느슨한 세포 펠렛을 확립하기 위해 10 분 동안 부드럽게 세포를 원심 후 LPS 무료 3퍼센트 NaCl의 여러 변화로 세포를 씻어. 혈액 세포의 분비 제품을 포함하고있는 세포의 추출물이 LPS 무료 증류수에 씻은 세포를 lysing으로 준비하실 수 있습니다. 이 lysate은 단백질 및 안티 미생물 면역 방어 10,11에서 작동 펩티드의 다양한 배열을 포함하고 또한 coagulogen, 세포 혈액 응고의 구조 단백질의 발효균 양식 및 coagulin에 coagulogen 변환 프로 테아제의 컬렉션이 포함되어 있습니다 응고의 12 원섬유에 polymerizes 단백질의 형태. 이 추출물은 lipopolysaccharide 13 존재에 대해 분석하는 데 사용되는 상용 제품 Limulus amebocyte lysate 또는 랄로 비슷합니다. coagulin에 coagulogen의 proteolytic 변형에 대한 책임을 테아제 계단식는 LPS 14 활성화됩니다.
  12. 출혈 후 동물의 처분. 위에 명시된 방법으로 실시 출혈 것은 동물에 의해 잘 용납입니다. 우즈 홀 해양 생물학에있는 연구소에서 일하는 때, 나는 그들이 살아남을 것이라는 예상과 함께 출혈 후 바다 동물을 반환합니다. 동물 말굽 게의 정상적인 범위에서 멀리 aquaria에 유지하는 경우, 그들은 한 달에 한 두 번 정도 반복해서 없어져야 수 있습니다. 아래에서 설명이므로, 포로 유지 동물은 높은 품질의 물 자주 먹이가 자신의 건강을 유지하기 위해 필요합니다. 안락사는 두 눈 사이 등의 정중선에 위치하고있는 등 지느러미 신경절의 파괴에 의해 수행할 수 있습니다.

플라즈마 처리 및 저장

  1. 프로 테아제의 보호. 플라즈마는 단백질 정화에 사용하는 경우, 그것은 즉시 수령 후 단백 분해 효소 억제제로 치료해야합니다. 1 ㎜의 최종 농도 phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)를 추가합니다. PMSF는 DMSO 또는 에탄올에 0.1 M의 주식 솔루션으로 보관됩니다. 그것은 물 15 상당히 불안정하므로 지속적인 보호에 의존 수 없다지만, 즉시 혈액 세포에서 플라즈마의 분리 이후 또한 세포에서 발표되었을 프로 테아제의 작은 수량을 inactivate 것입니다.
  2. 무균 여과 : 0.22 mm의 구멍 필터가 장착되어 일회용 중간 여과 장치를 사용하여 진공 하에서 ultrafiltration하여 플라즈마를 소독. 이러한 필터는 방해할하는 경향이 있습니다. 이 문제를 줄이기 위해 필터링하기 전에 플라즈마를 원심하는 것이 좋습니다 좋습니다. 플라즈마 대량 처리하는 경우, 그것은 먼저 0.45 mm 구멍 크기 Millipore 필터와 다음, 1mm의 구멍의 크기와 Millipore 필터를 사용하여 미리 필터 플라즈마 것이 좋습니다.
  3. 플라즈마는 0.2 MG / ML의 최종 농도 난 3 추가 또는 무균 여과하여 중 세균 오염으로부터 보호할 수 있습니다. Unsterile 플라즈마는 하나 또는 이러한 안티 박테리아 조치가 취해지고의 다른 않고 이일 이상 기간 동안 저장하면 안됩니다.
  4. 응고 혈액. 포유류의 응고 시스템과는 달리, Limulus 플라즈마 응고 혈액에 대한 요소의 상관이 없습니다. 대신, 응고 형성, 응고의 구조 단백질 (coagulogen)와 프로 테아제의 시스템에 대한 전체 기계 처리하는 coaguloge, 불용성 응고에 polymerizing의 그것이 가능한 렌더링 N은 혈액 세포 16 분비의 과립에서 발견된다. 그들이 exocytosis를 받아야하는 기회를 갖기도 전에 혈액 세포가 제거있다면, 플라즈마 응고에 대한 단백질의 완전한 자유이며 무한정 액체 상태로 유지됩니다.
  5. 단백질 정화. Hemocyanin 40 MG / ML 플라즈마에 존재하며 70 KDA의 subunit의 48 메르입니다. 그것은 ultracentrifugation (40,000 X g, 8 H) 또는 BioGel A5m 17로 큰 기공 크기 제외 수지로 겔 여과에 의해 격리 수 있습니다. C - 반응 단백질은 1 존재 - 5 MG / ML 있으며 칼슘 chelator 18 용리와 phosphorylethanolamine - 세파 로스에 친화 절연에 의해 격리 수 있습니다. 광범위한 스펙트럼 프로 테아제 억제제, 2 macroglogulin는 hemocyanin 및 C - 반응 단백질이 19 제거된 S - 300 수지 후 Sephacryl에 겔 여과에 의해 정화되었습니다.

문화의 운동성이있는 혈액 세포의 현미경 검사

  1. 체외에서 amebocyte 잔디의 설립 : LPS 무료 3% NaCl 용액은 멸균 플라스틱 페트리 스타일의 문화 요리 (35mm 요리, 60mm의 요리 2.5 ML, 90 ML 요리 6 ML 1 ML)에 추가됩니다. 혈액은 다음 방법을 사용하여 위에서 설명한 심장 주사하여 얻은지​​만, 멸균 주사기 바늘에 23 게이지, 1 14 게이지 바늘 대신 사용되는 수정과.입니다 혈액은 23 게이지 바늘에서 드롭하여 놓기를 흐르는 1 드롭은 35mm 요리, 60mm 요리에 3 방울, 그리고 100mm의 그릇에 9 방울로 수집됩니다. 혈액 세포는 다음 다시 앤 앞뒤 다음 원형 패턴에 부드러운 소용돌이 먼저하여 3퍼센트 NaCl 용액에 균일하게 혼합하고 있습니다. 준비가 혈액 세포가 접시의 표면에 첨부할 수 있도록 방 T에서 5 분 incubated이며, 다음 초기 호수는 선택 3 버퍼로 대체됩니다.
  2. 그것이 undegranulated 상태로 하층 연결된 혈액 세포를 유지하기 원하는 경우, 초기 호수 - 혈액 플라즈마 혼합물은 신선한 LPS 무료 3퍼센트 NaCl로 대체됩니다. 플라즈마도 LPS의 부재에서 혈액 세포의 자연 degranulation을 가속하고, 그 제거 세포의 undegranulated 상태를 안정화.
  3. 초기 생리가 살균 플라즈마로 대체하면, 혈액 세포는 순환 혈액 세포 (그림 5)의 난형의 모양에서 변환과 하층에 평평하게하고 degranulation 및 coagulin 세포 혈병의 레이어의 형성을 시작 플랫 amebocytes 20 잔디 위.

    그림 5

    그림 5

  4. 집계 amebocytes의 explant 문화 설립. 혈액 무균, LPS가없는 조건에서 수집되면, 혈액 세포 조직 같은 덩어리를 형성하기 위해 서스펜션과 총계에서 밖으로 정착. 이것에 대한 편리한 컨테이너 180 0 C. 4 H에 대한 부화하여 LPS 무료 렌더링 유리 배아 요리 19 게이지 바늘을 사용하여 심장 관통하여이 컨테이너에서 수집된 혈액은 1 incubated입니다 - 다음 객실 T, 1mm 스퀘어가 멸균 18 게이지 주사기 바늘로 amebocyte 집계에서 버렸어요 조각 2 H 두 coverglasses 또는 사이에 끼워 넣으면 아르 coverglass 및 스페이서 역할을 coverglasses의 조각으로 구분 슬라이드. 30 분 후, amebocytes들은 위상 대비 또는 DIC 광학 21 볼 수 있습니다 coverglass (그림 6A)에 explant의 주변에서 마이 그 레이션 시작합니다. 처음에는 마이 그 레이션하는 세포가 마이 그 레이션 하층 이상 연장 아르 유리 모양의 pseudopods (그림 6B (M))로 소형이며, 다음 표면과 접촉에 가만히있어 앞으로 운동이 pseudopod 22으로 세분화된 세포질의 흐름에 관련되어있다는 것을 . 나중에 전지 버리고 (그림 6B (F))와 degranulation를 시작 (그림 6B (D))과 운동 중지 23. 여기에 설명된 문화 챔버 문화 챔버에 다른 실험 요원의 재관류가 세포 운동성 및 과립 exocytosis 9 그들의 효과를 조사 수 있습니다. 현미경 검사를위한 amebocyte 문화의 확장 방법론 검토 24에서 찾을 수 있습니다.

    그림 6

    그림 6

aquaria에서 성인 말굽 올려 유지 보수

호르세쇼 게는 양질의 해수를 필요로하고 입자 여과, 폭기 및 물 25 탈질을 제공하는 정수 시스템을 갖추고 aquaria 유지하실 수 있습니다. 동물은 새우, 가재, 물고기, 또는 오징어에 2 ~ 3 회 일주일에 공급되어야합니다. 수유는 수족관, 괞찮아에서 동물을 제거하여 수행됩니다그 뒤에 그것을 cing, 그리고 입으로 음식을 배치. 배고파 경우, 동물은 곧 음식을 삼키는 시작됩니다. 그것이 바다의 물을 별도의 용기에 defecates이나 먹이가 시작된 후이 수족관에 제공될 수 있습니다까지 바닷물 시스템의 고도화에 따라 동물은 한시간 정도 유지한다. 장기 유지 관리를 위해, 동물은 등딱지의 표면에 녹색 또는 청록색 조류의 성장을 방지하기 위해 빛으로부터 멀리 보관해야합니다. 조류는 등딱지을 침식하고 어른 털갈이하지 않기 때문에, 이것은 동물 26 사망의 원인이됩니다. 야생에서 동물들은 부분적으로 모래에 묻힌 시간의 대부분을 보내고 있지만, 모래 또는 자갈 수족관의 장기 유지 보수를위한 중요한 청결의 수준을 유지하는 어려움을 보여줍니다.

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Discussion

말굽 게 4 종의, 동쪽의 북아메리카 해안 세 종 일본에서 벵골 만 해당 범위에서 Limulus polyphemus의가 있습니다. 해부학적인 몸의 구조와 유사한 형태가 27 4억4천5백만년 전에서 화석으로 발견 되었기 때문에 동물은 "살아있는 화석"으로 식별됩니다. 성숙에 도달 13 년 최소한 20 년은 28 생활 - 말굽 게 10을 필요로하는, 긴 동물을 나타냅니다. 그것은 장어와 콘치 어업 29 미끼로 광범위한 수확의 대상이되어 있지만, 미국의 말굽 크랩은 여전히 합리적인 풍부하며 비파괴 작은 성인 혈액의 50 ML의 수집 및에서 많은 400 ML 수 있습니다 대형 여성. 도이 정도의 혈액 수집은 10 분 미만으로 완료할 수 있습니다. 너무 작은 노력으로 많은 혈액을 내실수가 다른 어떤 즉시 사용할 수 무척추 동물의 알아요.

내독소에 대한 랄 테스트의 중요성, 그람 음성 박테리아의 존재에 대한 지표는 말굽 게 13 면역 시스템에 관심을 자극했다. 랄 시험은 읽기 아웃 응고 형성이나 단백 분해 효소 활동을위한 colorimetric 분석의와 함께, LPS 14 혈액 응고 시스템의 시작 프로 테아제의 활성에 따라 달라집니다. 가장 주목을받은 면역의 두 요소는 플라즈마의 단백질과 혈액 세포의 분비 과립의의 여러 단백질과 펩티드를하고 있습니다. 그 결과는 오래 사는 무척추 동물 11 가장 설명한 면역 체계를 갖는 상태로 말굽 게의 승격되었습니다

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Acknowledgments

위에서 설명한 기존 연구는 NSF 교부금 0,344,630에 의해 지원되었다.

References

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미국 호르세쇼 게, Limulus Polyphemus의 혈액 수집
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Armstrong, P., Conrad, M. Blood… More

Armstrong, P., Conrad, M. Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus. J. Vis. Exp. (20), e958, doi:10.3791/958 (2008).

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