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Biology

Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

Published: October 13, 2008 doi: 10.3791/958
Automatic Translation
1,2, 3
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Davis, 2Marine Biological Laboratory - MBL- woods hole, 3Department of Biological Sciences, Hunter College of CUNY

Summary

O caranguejo-ferradura americano, Limulus polyphemus, é sem dúvida a fonte mais conveniente para grandes quantidades de sangue de invertebrados. O sangue é simples na composição, com apenas um tipo celular na circulação geral, o Amebocyte granular, e apenas três proteínas abundante no plasma, hemocianina, as proteínas C-reativa e α2-macroglobulina. O sangue é coletado a partir do coração e as células de sangue e plasma são separados por centrifugação.

Abstract

O caranguejo-ferradura tem o melhor sistema imunológico caracterizada de qualquer invertebrados de vida longa. O estudo da imunidade em caranguejos-ferradura tem sido facilitada pela facilidade na coleta de grandes volumes de sangue e da simplicidade do sangue. Caranguejos-ferradura mostrar apenas um único tipo de células na circulação geral, o Amebocyte granular. O plasma tem o teor de sal da água do mar e apenas três proteínas abundantes, hemocianina, a proteína respiratória, as proteínas C-reativa, que funcionam na destruição citolítica de células estrangeiras, incluindo as células bacterianas, e α2-macroglobulina, que inibe as proteases de patógenos invasores. O sangue é coletado por punção cardíaca direta sob condições que minimizem a contaminação por lipopolissacarídeo (endotoxina, aka, LPS), um produto das bactérias Gram-negativas. Um animal de grande porte pode gerar 200-400 mL de sangue. Para o estudo do plasma, glóbulos são imediatamente removidos do plasma por centrifugação e do plasma pode ser fracionado em suas proteínas constituintes. As células do sangue são convenientemente estudado microscopicamente através da recolha de pequenos volumes de sangue em LPS-livre salina isotônica (0,5 M NaCl) em condições que permitam o exame microscópico direto, colocando uma das mais LPS-livre esfregaços na superfície placa de cultura, então a montagem dos esfregaços em câmaras de observação simples, após fixação das células. A preparação para a segunda observação direta é coletar 3-5 mL de sangue em um prato embrião LPS-livre e então explanting fragmentos de amebocytes agregados a uma câmara que sanduíches de tecido entre um slide e uma lamela. Nessa preparação, a amebocytes móveis migram para a superfície lamela, onde podem ser facilmente observadas. O sistema de coagulação do sangue envolve agregação de amebocytes ea formação de um coágulo extracelular de uma proteína, coagulin, que é liberado dos grânulos de secreção das células do sangue. Análise bioquímica de células do sangue lavado exige que a agregação e degranulação não ocorrer, o que pode ser realizado através da recolha de sangue para 0,1 volumes de 2% Tween-20, 0,5 M NaCl LPS-free, M seguida de centrifugação das células e lavagem com 0,5 NaCl.

Protocol

Características anatômicas do caranguejo-ferradura relevantes para sangramento (Fig. 1)

Figura 1

Figura 1

  1. Os três principais divisões do corpo, no sentido antero-posterior, são as prosoma (P), o opisthosoma (O), eo telson (T) 1.
  2. As margens anterior e lateral livre do prosoma é a flange.
  3. O recuo posterior mais do opisthosoma, onde o telson articula, é a baía terminal.
  4. A articulação onde o prosoma eo opisthosoma articular é a dobradiça (H).
  5. O coração está localizado ao longo da linha média dorsal, logo abaixo da carapaça de prostoma e 2 opisthosoma (Fig. 2).


    Figura 2

    Figura 2

Considerações gerais, esterilidade e proteção contra a exposição ao lipopolissacarídeo (endotoxina)

  1. O maior inimigo do sangramento de sucesso é a aglutinação celular, exocitose, ea formação do coágulo coagulin. Agregação celular e exocitose são estimulados por lipopolissacarídeo (endotoxina, aka, LPS), um produto das bactérias Gram-negativas. O limiar de concentração de LPS para exocitose de células lavadas é de 0,1 - 1 mg / mL, mas as células suspensas no plasma são ativados por concentrações significativamente mais baixos 3. Endotoxina não é inativado por autoclave simples e pode ser assumido como estar presente em superfícies e em soluções e reagentes que não são certificadas a endotoxina livre.
  2. Para reduzir as chances de coagulação durante a coleta de sangue, selecionar apenas perfeito, sem danos para os animais sangramento. Pré-chill os animais 02/01 h na sala de 4 ° C. Prática técnica estéril. Evitar a contaminação com endotoxina.
  3. LPS sem solução salina a 3% é usada na medicina clínica e pode ser comprado de fornecedores de produtos médicos (veja a tabela de reagentes especializada e fornecimentos). LPS pode ser removido do vidro e metal por incubação a 180 ° C por 4 horas. Estéreis as agulhas de seringa de uso único, placas de Petri de estilo, cultura e tubos de tampa de rosca centrífuga são todos LPS-gratuitas e podem ser usados ​​sem modificação, desde que técnica estéril adequada é praticada.
  4. A estabilidade das células do sangue de diferentes animais é diferente, com as células de alguns animais individuais submetidos degranulação espontânea, resultando na formação do coágulo coagulin, mesmo quando o animal é sangrado com o maior cuidado. As células do sangue de outros individuais caranguejos-ferradura são significativamente mais estável e, quando os procedimentos apropriados sejam seguidos, permanecem totalmente granular durante a sangria ea separação de células de plasma.
  5. Vários agentes têm sido relatadas para estabilizar as células do sangue após hemorragias, inclusive a cafeína (0,25 sangram em volumes de 10 mM de cafeína em LPS-livre NaCl 3%) 4, propranolol (1 mM de concentração final) 5, 6 dimetilsulfóxido, a quelação cátion bivalente ( sangram em um volume igual de 0,1 M dextrose, citrato de sódio 0,03 M, 0,026 M de ácido cítrico, 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético dissódico (Na 2 EDTA), pH 4,6) 7, inibidores da proteína G e fosfolipase-C vias (cólera e toxinas pertussus, U73122) 8, a substituição de cloreto com anion isetionato 9, bloqueadores de canal de cloreto de 9 de AMP cíclico antagonistas 9, reagentes sulfidrílicos (5 mM N-etil maleimida, NEM) 5, ea membrana-ativo detergente Tween-20 ( sangramento em 0,1% volume 2 Tween-20 em LPS-free 0,5 M NaCl).

Suprimentos e reagentes para a sangria do caranguejo-ferradura: recolha de grandes volumes de sangue

  1. um ou mais grandes, caranguejo-ferradura sem danos
  2. garrafa de esguicho contendo etanol a 70%
  3. Kimwipes
  4. Agulha de calibre 14
  5. forceps resistente
  6. balde de gelo com gelo
  7. 50 mL tampa de rosca de plástico descartáveis ​​tubos de centrífuga
  8. rack para segurar a tubos de 50 ml
  9. counter-top centrífuga
  10. estéril 50 mL pipetas sorológicas
  11. lâmpada do tipo de enchimento de pipetas
  12. aparelho de filtro estéril e descartável
  13. bomba de vácuo
  14. LPS sem solução a 3% NaCl (para coleta de células do sangue)
  15. Tween-20 (para a coleta de células do sangue)

Preparativos para grande volume de sangramento

  1. Para o sangramento, use animais grandes, sem danos. Esfriar o animal para 1 h em uma sala fria antes de sangramento.
  2. Estabelecer um acordo confortável com um suporte estável para um balde de gelo que é cerca de 0,3 metros de altura (o recipiente descartável de isopor na discussão reagentes frio ou congelado é o caso) e uma cadeira baixa para o operador. O balde de gelo é colocado sobre a estrutura de apoio ea cadeira é desenhadaaté esta unidade. Você deve ser confortável sentado por um longo período na cadeira com os cotovelos nas coxas, e com a mão esquerda segurando um caranguejo-ferradura lutando posicionado acima dos tubos de coleta de sangue na vertical apoiado em uma cama de gelo no balde de gelo.
  3. Pré-chill 4-6 da 50 mL tubos de plástico descartáveis ​​centrífuga com fecho de rosca no banho de gelo. Os tubos são erguidas no gelo variou em torno do perímetro do contêiner de banho de gelo. Pouco antes de iniciar a operação de sangria, retire as tampas dos tubos e tampas de lugar na mesa ao lado, aderindo à técnica estéril.
  4. Remova a tampa de uma agulha ga 14 e use a pinça resistente para soltar a agulha em sua capa, mas não retire a agulha da manga. Manter a esterilidade. NÃO TOQUE EM QUALQUER PARTE DA AGULHA com os dedos. Manga lugar com agulha sobre um contador adjacentes com a bunda exposta da agulha elevada do contato com qualquer superfície para manter a sua esterilidade.
  5. Umedeça um Kimwipe com etanol 70%.

Sangrar o animal (especificamente para o operador destro)

  1. Segurando o animal para o sangramento: animal agarrar na mão esquerda com os quatro dedos em contato com a flange anterior do prosoma eo polegar segurando a parte posterior do opisthosma na base da cauda (da baía terminal). A superfície ventral do animal enfrenta a palma da sua mão. O telson fica ao longo da base do polegar e projetos sobre o pulso. Flex o animal delicadamente, para que prosoma e opisthosoma são perpendiculares entre si (Figura 3a).

    Figura 3

    Figura 3

  2. Limpe o exposto dobradiça prosoma conjunto de ligação e opisthosoma com etanol a 70%, aplicada com uma etanol Kimwipe umedecido (Figura 3b).
  3. Girar a mão esquerda de tal forma que os dedos 2-4 estão em primeiro lugar ea superfície dorsal do animal para cima. Com a mão direita, inserir a agulha da seringa 14 ga, ainda em sua capa protetora, entre os dedos 2 e 3 da mão esquerda. Pegue a pinça na mão direita e retire a agulha da sua capa protetora, segurando a coronha com a pinça (Figura 3c). Girar a mão esquerda de modo que a superfície dorsal da mão rostos para o polegar, dedo indicador esquerdo e estão em alta, e se o animal está de cabeça para baixo, com sua superfície dorsal de frente para a mão direita. Posicione o butt da agulha acima do primeiro dos tubos de 50 ml de coleta e animais orientar o modo que a ponta da agulha está apontado para a dobradiça conjunta e de modo que o eixo da agulha é paralela à linha média dorsal (Figura 3d). Inserir a ponta da agulha através da articulação conjunta para a luz do coração, mantendo a agulha posicionada paralela à linha média dorsal e inserido na linha média e com a coronha da agulha ainda posicionado acima da abertura do tubo de coleta. A agulha é introduzida aproximadamente 1 - 2 cm de profundidade para a parte do coração no prosoma. Assim como o coração é perfurado, o sangue fluirá rapidamente (Figura 4a, seta), por isso é importante para garantir que o final de entrega da agulha da seringa é posicionada sobre a boca do tubo de coleta de recolher que surto inicial de sangue.
  4. Sangue sair do coração, inicialmente, em um fluxo contínuo que, depois de cerca de 30-50 mL de sangue foram coletadas, irá diminuir a quedas individuais (Figura 4b). Para melhorar o fluxo de sangue, pode ser uma boa política para re-orientar a ponta da agulha ligeiramente. Inclinar a agulha para cima ou para baixo, esquerda ou direita; deslize a ponta mais fundo no coração ou puxá-lo para mais perto da dobradiça conjunta para encontrar a posição que otimiza o fluxo de sangue. Não comprimir excessivamente o animal, porque esta riscos danificar o animal e pode causar o sangue extravasado para iniciar a coagulação.

    Figura 4

    Figura 4

  5. Como cada tubo de coleta se enche de sangue, gire o banho de gelo para levar o próximo tubo vazio embaixo no final de entrega da agulha.
  6. Como sangramento diminui, você corre o risco de ter o fluxo de ar em uma direção retrógrada na agulha e no coração. Isso pode ocorrer quando o animal estica, reduzindo assim a pressão arterial. Tente evitar isso mantendo o animal em posição de flexão ou permitindo alisamento a ocorrer lentamente.
  7. Quando o animal pára de dar sangue, remover a agulha sangramento do coração. Feche a coleção tubos e centrifugar imediatamente na tabela-top centrífuga, 1000 RPM, 5 min. Os glóbulos formarão pelotas compacta no fundo dos tubos de coleta. Porque todos os componentes para a coagulação do sangue estão contidos dentro de vesículas secretoras das células do sangue, assim como o plasma é separado das células,o risco de coagulação do plasma é eliminado.
  8. É imperativo evitar a coagulação do sangue extravasado. As seguintes medidas reduzir o risco de coagulação: Pré-chilling o animal e manter os tubos de coleta em um banho de gelo; manuseio suave do animal; redução da rapidez com que o sangue flui para fora da agulha da seringa; centrifugação do sangue imediatamente após a colheita, à prevenção da contaminação de agulhas e tubos de coleta com endotoxina; manutenção de procedimento estéril. Como foi mencionado acima, alguns animais individuais têm glóbulos especialmente irritado que iniciam exocitose mesmo quando estas precauções forem seguidas.
  9. Após a centrifugação, inspecionar os tubos de sinais de coagulação do sangue - cordões de células e material de coágulo gelatinoso presas às paredes do tubo, material gelatinoso no topo do coágulo, ou, pior, uma grande quantidade de coágulo com células sangüíneas entremeadas no coluna de fluido (Figura 4c, seta). O material desses tubos de soro não é, plasma, e contém os produtos secretados das células do sangue.
  10. Transferir o plasma para tubos estéreis com os 50 mL pipeta estéril sorológica. Tenha cuidado ao pipetar para evitar a aspiração de qualquer uma das células do pellet de células no fundo do tubo. É melhor deixar alguns mililitros de plasma acima do pellet para não perturbar o pellet celular.
  11. O procedimento descrito acima é projetado para coletar grandes volumes de plasma contaminado pelos produtos de secreção das células do sangue. Para coletar grandes volumes de células do sangue lavado, coleta de sangue em 0,1 volumes de 2% Tween-20 dissolvido em solução 3% NaCl LPS-livre. Centrifugar as células suavemente durante 10 minutos para estabelecer uma soltas pellet celular, em seguida, lavar as células com diversas mudanças de LPS sem NaCl 3%. Um extrato das células que contém os produtos de secreção das células do sangue podem ser preparados por lise das células lavadas em LPS-livre de água destilada. Este lisado contém um diversificado leque de proteínas e peptídeos que atuam no anti-microbial defesa imunológica 10,11 e também contém coagulogen, a forma zimogênio da proteína estrutural do coágulo de sangue extracelular, ea recolha de proteases, que convertem a coagulogen coagulin, a forma da proteína que polimeriza para as fibrilas dos 12 coágulo. Este extracto é semelhante ao produto comercialmente disponível, Limulus Amebocyte lisado ou LAL, que é usado para ensaio para a presença de lipopolissacarídeo 13. A cascata da protease responsável pela modificação proteolítica da coagulogen para coagulin é ativado por LPS 14.
  12. Disposição dos animais após a hemorragia. Sangramento conduzida pelos métodos acima identificado é bem tolerado pelo animal. Quando se trabalha no Laboratório de Biologia Marinha de Woods Hole, volto animais para o oceano, depois da sangria, com a expectativa de que eles vão sobreviver. Se os animais são mantidos em aquários distante da faixa normal de caranguejos-ferradura, eles podem ser sangrou várias vezes uma ou duas vezes por mês. Como é descrito abaixo, os animais mantidos em cativeiro necessitam de água de alta qualidade e alimentação freqüente para manter sua saúde. A eutanásia pode ser realizado pela destruição do gânglio dorsal, que se situa na linha média dorsal entre os olhos.

Processamento e armazenamento de plasma

  1. Proteção contra proteases. Se o plasma deve ser utilizada para a purificação de proteínas, ela deve ser tratada com inibidores da protease imediatamente após a coleta. Adicionar phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) para uma concentração final de 1 mM. PMSF é mantido como uma solução estoque 0,1 M em DMSO ou etanol. É muito instável em água 15, por isso não pode ser invocado para proteção duradoura, mas além imediatamente após a separação do plasma das células do sangue vai inativar a pequenas quantidades de proteases que poderiam ter sido liberado das células.
  2. Filtração estéril: esterilizar o plasma por ultrafiltração, sob vácuo, usando um dispositivo de médio-filtração descartáveis ​​equipado com um filtro de poro 0,22 mm. Estes filtros têm uma tendência a entupir. Aconselha-se a centrifugação do plasma antes de filtragem para reduzir este problema. Se grandes volumes de plasma são processados, é aconselhável pré-filtro plasma o primeiro utilizando um filtro Millipore com poros de 1 mm, em seguida, com uma 0,45 milímetros tamanho dos poros do filtro Millipore.
  3. Plasma pode ser protegido de contaminação bacteriana ou por adição de NaN 3 para uma concentração final de 0,2 mg / ml ou por filtração estéril. Unsterile plasma nunca devem ser armazenados por períodos superiores a dois dias sem um ou outro desses medidas anti-bacteriana sendo tomadas.
  4. Coagulação do sangue. Ao contrário do sistema de mamíferos de coagulação, o plasma Limulus contém nenhum dos elementos para a coagulação sanguínea. Em vez disso, a máquina inteira para a formação de coágulos, a proteína estrutural do coágulo (coagulogen) eo sistema de proteases que coaguloge processon para torná-lo capaz de polimerização para o coágulo insolúvel, é encontrada nos grânulos de secreção das células do sangue 16. Portanto, se as células do sangue são removidos antes que eles tenham a chance de se submeter exocitose, o plasma é inteiramente livre das proteínas de coagulação e permanecerá indefinidamente fluidos.
  5. Purificação de proteínas. Hemocianina está presente em 40 mg / mL no plasma e é um 48-mer de uma subunidade kDa 70. Pode ser isolado por ultracentrifugação (40.000 X g, 8 h) ou filtração em gel com um grande resina exclusão tamanho dos poros, como Biogel A5m 17. As proteínas C-reativa estão presentes em 1-5 mg / mL e pode ser isolado pelo isolamento de afinidade em Sepharose-phosphorylethanolamine, com eluição com um quelante de cálcio 18. O inibidor de protease de largo espectro, um 2-macroglogulin, foi purificado por filtração em gel em Sephacryl S-300 da resina após hemocianina e as proteínas C-reativa foram removidos 19.

Exame microscópico das células do sangue móveis na cultura

  1. Estabelecimento de relvados Amebocyte in vitro: LPS-livre 3% de solução NaCl é adicionado ao plástico placas de Petri estéreis estilo de cultura (1 mL para um prato de 35 mm, 2,5 mL para um prato de 60 mm, 6 mL para um prato mL 90). O sangue é então obtido por punção cardíaca, usando o método descrito acima, mas com a modificação que um calibre 23, uma agulha de seringa no estéril é usada no lugar da agulha de calibre 14. O sangue flui gota a gota-a partir da agulha de calibre 23 e 1 gota é coletado no prato de 35 mm, 3 gotas no prato de 60 mm e 9 gotas no prato de 100 mm. As células do sangue são misturados de maneira uniforme na solução 3% NaCl por circulares suaves, primeiro em um padrão circular, então de volta-e-vem. A preparação é incubada por 5 min em T espaço para permitir que as células do sangue para anexar à superfície do prato, então a solução salina inicial é substituído com um buffer de escolha 3.
  2. Se for desejado para manter as células-substrato ligado sangue em uma condição undegranulated, a mistura salina-plasma inicial sangue é substituído por LPS-livre fresco NaCl 3%. Plasma acelera a degranulação espontânea das células do sangue, mesmo na ausência de LPS, e sua remoção estabiliza o estado undegranulated das células.
  3. Se a solução salina inicial é substituído por plasma estéril, as células do sangue transformar de forma ovóide da célula do sangue circulante (Fig. 5) e achatar sobre o substrato, e depois iniciar a degranulação ea formação de uma camada do coágulo de sangue coagulin extracelular acima do gramado de amebocytes achatado 20.

    Figura 5

    Figura 5

  4. Estabelecimento de culturas de explante amebocytes agregados. Quando o sangue é coletado em estéril, livre de LPS condições, as células do sangue resolver fora da suspensão e agregados para formar uma massa de tecido-like. Um recipiente adequado para isso é o prato de vidro embrião prestados LPS-livre de incubação por 4 horas a 180 0 C. De sangue coletadas neste recipiente por punção cardíaca, utilizando uma agulha de calibre 19 é incubadas por 1-2 h em T quarto, então pedaços 1 mm, são cortados do agregado Amebocyte com uma agulha de seringa estéril calibre 18 e imprensado entre dois esfregaços ou um lamínula e um slide separados por fragmentos de esfregaços para atuar como espaçadores. Após cerca de meia hora, amebocytes começar a migrar da periferia do explante sobre a lamela (Fig. 6a), onde podem ser vistos com contraste de fase ou óptica DIC 21. Inicialmente, as células migram são compactos com hialina pseudópodes (Fig. 6b (m)) que se estendem acima do substrato, migração e que, então, são reduzidos em contato com a superfície e movimento para a frente envolve o fluxo de citoplasma granular para os 22 pseudópode . Posteriormente, as células flatten (Fig. 6b (f)) e iniciar degranulação (Fig. 6b (d)) e deixar de locomoção 23. A câmara de cultura descrito aqui permite que a perfusão de diferentes agentes experimental na câmara de cultura para investigar seus efeitos sobre a motilidade celular e exocitose de grânulos 9. Uma avaliação extensiva metodológica da cultura Amebocyte para exame microscópico pode ser encontrada em 24.

    Figura 6

    Figura 6

Manutenção de caranguejos-ferradura adultos em aquários

Caranguejos-ferradura requerem água do mar de alta qualidade e pode ser mantido em aquários equipados com um sistema de purificação de água que fornece filtragem de partículas, aeração, e desnitrificação da água 25. Animais devem ser alimentados 2 ou 3 vezes por semana em camarão, lagosta, peixe ou lula. Alimentação é realizada através da remoção do animal do aquário, placing-lo em suas costas, e colocando a comida na boca. Se com fome, o animal começará em breve a engolir os alimentos. Dependendo da sofisticação do sistema de água do mar, o animal deve ser mantido por uma hora ou mais até que defeca em um recipiente separado da água do mar ou pode ser devolvido ao aquário após a alimentação já começou. Para manutenção a longo prazo, o animal deve ser mantido longe da luz para evitar o crescimento de algas verdes ou azul-esverdeada na superfície da carapaça. Algas corroer a carapaça e uma vez que o adulto não muda, isso vai causar a morte ao animal 26. No selvagem, os animais passam a maior parte do tempo parcialmente enterrado na areia, mas areia ou cascalho no aquário apresenta uma dificuldade em manter o nível de limpeza importante para a manutenção a longo prazo.

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Discussion

Existem quatro espécies de caranguejo-ferradura, polyphemus Limulus da costa leste da América do Norte e três espécies que vão do Japão para a Baía de Bengala. O animal é identificado como um "fóssil vivo" por formas anatomicamente semelhantes foram encontrados como fósseis de 445 milhões de anos atrás 27. O caranguejo-ferradura representa um animal de vida longa, exigindo 10-13 anos para atingir a maturidade e viver pelo menos 20 anos 28. Embora tenha sido submetido a colheita extensa como isca para a pesca da enguia e conch 29, o caranguejo-ferradura americano ainda é razoavelmente abundante e permite a coleta não destrutiva de 50 mL de sangue de um adulto pequeno e, tanto quanto 400 mL de uma fêmea grande. Coleta de sangue, mesmo este tanto pode ser concluído em menos de 10 minutos. Não conheço nenhum outro invertebrado prontamente disponível que oferece tanto sangue com tão pouco esforço.

A importância do teste LAL para endotoxina, um indicador para a presença de bactérias Gram-negativas, tem estimulado o interesse no sistema imunológico do caranguejo-ferradura 13. O teste LAL depende da ativação da protease início do sistema de coagulação do sangue por LPS 14, com uma leitura de formação de coágulos ou de um ensaio colorimétrico para atividade de protease. Os dois elementos da imunidade que tenham recebido a maior atenção foram as proteínas do plasma e as proteínas e peptídeos vários dos grânulos de secreção das células do sangue. O resultado foi a elevação do caranguejo-ferradura ao status de ter o melhor descrito o sistema imunológico para qualquer invertebrados de longa duração 11

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Acknowledgments

Pesquisa original descrito acima foi apoiado pela NSF conceder 0344630.

References

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Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus
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Armstrong, P., Conrad, M. Blood… More

Armstrong, P., Conrad, M. Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus. J. Vis. Exp. (20), e958, doi:10.3791/958 (2008).

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