Summary
Transgena (Tg) musmodeller av AD ger ett utmärkt tillfälle att undersöka hur och varför A-beta-eller tau nivåer i CSF förändras allteftersom sjukdomen fortskrider hos människor. Här visar vi ett raffinerat Cisterna Magna punktera teknik för seriell CSF provtagning från musen.
Abstract
Alzheimers sjukdom (AD) är en progressiv neurodegenerativ sjukdom som patologiskt kännetecknas av extracellulära deposition av β-amyloid peptid (A-beta) och intraneuronala ansamling av hyperphosphorylated tau protein. Eftersom cerebrospinalvätska (CSF) är i direkt kontakt med det extracellulära rummet i hjärnan, det ger en återspegling av den biokemiska förändringar i hjärnan som svar på patologiska processer. CSF från AD patienter visar en minskning av 42 aminosyror i form av A-beta (Aβ42) och ökar totalt tau och hyperphosphorylated tau, även om mekanismer som ansvarar för dessa förändringar är ännu inte helt klarlagda. Transgena (Tg) musmodeller av AD ger ett utmärkt tillfälle att undersöka hur och varför A-beta-eller tau nivåer i CSF förändras allteftersom sjukdomen fortskrider. Här visar vi ett raffinerat Cisterna Magna punktera teknik för CSF provtagning från musen. Denna extremt skonsam provtagningsteknik kan seriella CSF prover som fås från samma mus med 2-3 månaders intervall som kraftigt minimerar påverkande effekt på mellan-mus variation i A-beta-eller tau nivåer, vilket gör det möjligt att upptäcka subtila förändringar över tid. I kombination med A-beta och tau ELISA, kommer denna teknik vara användbar för studier som syftar till att undersöka förhållandet mellan nivåerna av CSF Aβ42 och tau, och deras ämnesomsättning i hjärnan i modeller AD mus. Studier i Tg möss kan ge viktiga validering som till den potentiella av CSF A-beta-eller nivåer tau att användas som biologiska markörer för att övervaka sjukdomsförloppet, och för att kontrollera effekten av terapeutiska ingrepp. Som mössen kan offras och hjärnan kan undersökas biokemiska eller histologiska förändringar kan mekanismerna bakom CSF förändringar bättre bedömas. Dessa data kommer sannolikt att vara informativ för tolkning av mänskliga förändringar AD CSF.
Protocol
Dra glaset kapillärröret
- Glaset kapillärröret köps från Sutter Instrument Inc (borosilikatglas, B100-75-10).
- Dra kapillärrör på en Sutter P-87 Flaming mikropipett avdragare med värmeindex satt till 300 och trycket index satt till 330.
- Klipp spetsen på glaset kapillärröret med sax, så att den avsmalnande spets har en inre diameter på ca 0,5 mm.
Cisterna Magna punktera teknik för CSF
CSF-prover tas från Cisterna magna (figur 1) med en metod som publicerades tidigare 1. 
Figur 1
1. Mössen är anesthesized av ketamin (100mg/kg) och xylazin (10mg/kg) givet intraperitonealt. Under den tid av anestesi induktion, är de möss förvaras i 37 ° C inkubator.
2. Huden på halsen är rakade, och musen placeras sedan liggande på stereotaxic instrument med direkt kontakt med en värmedyna. En rektaltemperatur sond förs in i ändtarmen så att värmen produceras av värmedyna justeras med anledning av förändringarna i kroppstemperatur. Huvudet är säkrad med huvudet adaptrar. Operationsområdet är tvättas med 10% povidonjodid, följt av 7 0% etanol (upprepa 3 gånger), och en sagittal snitt i huden görs sämre till nackknöl.
3. Enligt dissektion mikroskop, (M. biventer cervicis och M. rectus capitis dorsalis större) den subkutana vävnaden och musklerna åtskiljs av dissektion med pincett. Ett par microretractors används för att hålla musklerna isär.
4. Musen har fastställts så att huvudet bildar en nästan 135 o vinkel med kroppen.
5. Enligt dissektion mikroskop, visas dura mater av Cisterna magna som en glittrande och klart omvänd triangel genom vilka förlängda märgen och ett stort blodkärl (arteria dorsalis spinalis) och CSF utrymmet är synliga (Figur 2). 
Figur 2
6. Den dura mater är avtorkning med steril bomullspinne. Penetrera kapillärrör i Citerna Magna genom dura mater, laterala och arteria dorsalis spinalis (figur 2). Efter en märkbar förändring i motståndet mot kapillärrör insättningen flyter CSF i kapillärrör.
7. Ta försiktigt bort kapillärröret, och koppla den till en 3 ml spruta med en polyeten slang som har en 1 mm innerdiameter. Injicera CSF i en pre-märkt 0,5 ml Eppendorf-rör, och frysa röret omedelbart på torr is och sedan överföra den till en -80 ° C frys.
8. Efter CSF provtagning, musklerna åter samman, och huden sys (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Ca 1 ml 0,9% NaCl injiceras subkutant för att förhindra att de-hydrering. Musen hålls på inkubatorn för att upprätthålla kroppstemperaturen tills den återhämtat sig, vikten på musen övervakas 1 dag och 1 vecka efter operationen.
Resultat och Diskussion
Vi beskrev en mycket tillförlitlig protokoll för seriell provtagning av cerebrospinalvätskan från möss utan detekterbar plasma kontaminering.
1. Hela proceduren brukar ta 10 min per mus (inklusive anestesi). Volymen av likvor erhålls är beroende av musstammar. I PS / APP dubbla Tg möss vi använde 2, är den genomsnittliga volymen ca 5 l (3-7 l), medan P301L (JNPL3) möss 3 ger en avkastning på cirka 10 l-15 l. För seriell provtagning kan maximalt 7-8 l säkert tas varje gång med ett intervall på 2-3 månader.
2. Under operationen är det viktigt att positionera huvudet och kroppen med musen ordentligt på stereotaxic ram så att dura mater på Cisterna magna kan utsättas tillräckligt. Försiktigt undvika blodkärlen när penetrera dura mater med kapillärröret att förhindra förorening från plasma proteiner, som kan övervakas i CSF provet genom immunoblotting för ApoB 4.
3. Minimera vävnadsskada vid varje operation är viktigt, eftersom vävnaden KONGLUTINATION kan öka svårigheten med predisponerande blödning för följande provtagning.
4. Kroppstemperaturen måste vara väl underhållna under operationen eftersom hypotermi orsakad av anestesi kan väsentligt påverka fosforyleras tau nivåer i hjärnan mycket snabbt 5.
5. AB ELISA-protokoll och antikroppar som vi använde beskrevs i detalj i Refolo et al. 6. Två ìl av CSF från PS / APP möss ger tillfredsställande resultat vid spädning 1:50-1:60. För tau ELISA kommer 4-5 l CSF från P301L (JNPL3) möss vara tillräckligt förupptäckt av totalt tau, eller tau fosfor ylated på treonin 231 (Kit köps från Bio-Source).
6. Denna teknik kan tillämpas på andra musmodeller av neurologiska sjukdomar, som en liten volym CSF är tillfredsställande för önskad analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskrev en mycket tillförlitlig protokoll för seriell provtagning av cerebrospinalvätskan från möss utan detekterbar plasma kontaminering.
1. Hela proceduren brukar ta 10 min per mus (inklusive anestesi). Volymen av likvor erhålls är beroende av musstammar. I PS / APP dubbla Tg möss vi Begagnat2 är den genomsnittliga volymen ca 5 l (3-7 l), medan P301L (JNPL3) möss 3 ger en avkastning på cirka 10 l-15 l. För seriell provtagning kan maximalt 7-8 l säkert tas varje gång med ett intervall på 2-3 månader.
2. Under operationen är det viktigt att placera huvudet och kroppen med musen ordentligt på stereotaxic ram så att dura mater på Cisterna magna kan utsättas tillräckligt. Försiktigt undvika blodkärlen när penetrera dura mater med kapillärröret att förhindra förorening från plasma proteiner, som kan övervakas i CSF provet genom immunoblotting för ApoB 4.
3. Minimera vävnadsskada vid varje operation är viktigt, eftersom vävnaden KONGLUTINATION kan öka svårigheten med predisponerande blödning för följande provtagning.
4. Kroppstemperaturen måste vara väl underhållna under operationen eftersom hypotermi orsakad av anestesi kan väsentligt påverka fosforyleras tau nivåer i hjärnan mycket snabbt 5.
5. AB ELISA-protokoll och antikroppar som vi använde beskrevs i detalj i Refolo et al. 6. Två ìl av CSF från PS / APP möss ger tillfredsställande resultat vid spädning 1:50-1:60. För tau ELISA, 4-5 l CSF från P301L (JNPL3) möss kommer att vara tillräcklig för detektering av totalt tau, eller tau fosforyleras på treonin 231 (är Kits köps från Bio-Source).
6. Denna teknik kan tillämpas på andra musmodeller av neurologiska sjukdomar, som en liten volym CSF är tillfredsställande för önskad analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vårt arbete stöds av NIH bidrag NS048447 och AG017216to KD. Li Liu vill tacka Dr Heikki Tanila (universitetet i Kuopio, Kuopio, Finland) för hans handledning och stöd under utvecklingen av det ursprungliga protokollet.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
