Summary
نماذج معدلة وراثيا الماوس (تيراغرام) من م يوفر فرصة ممتازة لمعرفة كيف ولماذا أو Aβ تاو المستويات في CSF تتغير مع تقدم المرض في المرضى من البشر. هنا ، ونحن يبرهن على وجود ثقب المكرر ماجنا صهريج تقنية لأخذ عينات من السائل النخاعي التسلسلي الماوس.
Abstract
مرض الزهايمر (ميلادي) هو مرض الاعصاب التدريجي الذي يميزه عن طريق الترسيب مرضي من خارج الخلية β اميلويد ببتيد (Aβ) ، وتراكم للبروتين تاو intraneuronal hyperphosphorylated. لأن السائل النخاعي (CSF) هو على اتصال مباشر مع الفضاء خارج الخلية في الدماغ ، فإنه يوفر انعكاس للتغيرات بيوكيميائية في الدماغ ردا على العمليات المرضية. CSF من المرضى ميلادي نقصانا في شكل الحامض الأميني 42 من Aβ (Aβ42) ، والزيادة في إجمالي تاو تاو وhyperphosphorylated ، رغم ما زالت الآليات المسؤولة عن هذه التغيرات غير مفهومة تماما. نماذج معدلة وراثيا الماوس (تيراغرام) من م يوفر فرصة ممتازة لمعرفة كيف ولماذا أو Aβ تاو المستويات في CSF تتغير مع تقدم المرض. هنا ، ونحن يبرهن على وجود ثقب المكرر ماجنا صهريج تقنية لأخذ عينات السائل النخاعي من الماوس. هذا الأسلوب أخذ العينات لطيف للغاية يتيح الحصول على عينات من السائل النخاعي المسلسل من الماوس نفسه على فترات 2-3 الشهر الذي يقلل كثيرا من أثر الخلط بين الفأر التباين في مستويات أو Aβ تاو ، مما يجعل من الممكن الكشف عن التغييرات الطفيفة على مر الزمن. بالاشتراك مع Aβ وتاو ELISA ، فإن هذا الأسلوب مفيدا لإجراء دراسات تهدف إلى التحقيق في العلاقة بين مستويات Aβ42 CSF وتاو ، والتمثيل الغذائي في المخ في نماذج الماوس ميلادي. يمكن أن الدراسات التي أجريت في الفئران تيراغرام توفير التحقق من صحة المهم بالنسبة لإمكانات Aβ CSF أو مستويات تاو لاستخدامها كعلامات البيولوجية لمراقبة تطور المرض ، ورصد تأثير التدخلات العلاجية. كما يمكن التضحية الفئران ويمكن فحص أدمغة للتغيرات كيميائية حيوية أو النسيجي ، يمكن الآليات الكامنة وراء التغيرات CSF تقييمها على نحو أفضل. هذه البيانات من المحتمل أن تكون مفيدة لتفسير التغيرات البشرية CSF ميلادي.
Protocol
سحب أنبوب زجاجي الشعرية
- يتم شراء أنبوب زجاجي الشعرية من وثيقة المؤتمر الوطني العراقي سوتر (البورسليكات الزجاج ، B100 - 75 - 10).
- سحب الأنابيب الشعرية على سوتر P - 87 يلهب micropipette مجتذب ، مع مؤشر الحرارة التي وضعت في 300 ومؤشر الضغط على تعيين 330.
- تقليم غيض من أنبوب زجاجي الشعري مع مقص ، وحتى يتسنى للطرف مدبب ويبلغ قطرها الداخلي حوالي 0.5 مم.
صهريج تقنية ثقب ماجنا لCSF
وتؤخذ عينات من السائل النخاعي ماجنا صهريج في (الشكل 1) باستخدام الطريقة التي تنطبق عليها 1. 
الشكل 1
1. والفئران التي anesthesized الكيتامين (100mg/kg) وزيلازين (10mg/kg) ، intraperitoneally تديرها. خلال ذلك الوقت من تحريض التخدير ، ويتم الاحتفاظ الفئران في الحاضنة 37 درجة مئوية.
2. وحلق جلد الرقبة ، ويوضع بعد ذلك عرضة الماوس على صك التجسيمي اتصال مباشر مع وسادة التدفئة. يتم إدخال مسبار درجة حرارة المستقيم في المستقيم بحيث يتم ضبط الحرارة التي ينتجها سادة التدفئة في استجابة للتغيرات في درجة حرارة الجسم. يتم تأمين الرأس مع محولات الرأس. غير ممسوح الموقع الجراحية مع بوفيدون اليود 10 ٪ ، تليها الايثانول 7 0 ٪ (اكرر 3 مرات) ، ويتم إجراء شق السهمي السفلي من الجلد إلى قفا.
3. تحت المجهر التشريح والأنسجة تحت الجلد والعضلات (متر ومتر ذات البطنين الرقبية المستقيمة الرأسية الرئيسية الظهراني) مفصولة تشريح صريحة مع ملقط. ويستخدم زوج من microretractors لعقد العضلات إربا.
4. وضعت الماوس لأسفل بحيث تشكل زاوية الرأس نحو 135 س مع الجسم.
5. تشريح تحت المجهر ، وجافية من صهريج للماجنا يظهر مثلث معكوس لامعة واضحة يمكن من خلالها للبصلة والاوعية الدموية الرئيسية (الشريان الظهراني النخاعي) ، والفضاء CSF مرئية (الشكل 2). 
الشكل 2
6. ونشف لجافية جافة مع مسحة القطن المعقم. اختراق الأنابيب الشعرية إلى ماجنا citerna وخلال جافية ، الوحشي للنخاع الشريان الظهراني (الشكل 2). بعد تغيير ملحوظ في مقاومة الإدراج الأنابيب الشعرية ، وCSF يصب في الأنبوب الشعري.
7. إزالة بعناية الأنابيب الشعرية ، وتوصيله إلى حقنة 3 مل من خلال أنابيب البولي ايثيلين الذي يبلغ قطره 1 مم الداخلية. حقن السائل النخاعي في مرحلة ما قبل وضع علامة أنبوب 0.5 مل إيبندورف ، وتجميد الأنبوب فورا على الثلج الجاف ومن ثم نقلها الى التجميد -80 درجة مئوية.
8. CSF بعد أخذ العينات ، وعضلات إعادة الانحياز ، وخياطة الجلد (4-0 ، Ethicon ، جونسون أند جونسون). يتم حقن حوالي 1 مل من كلوريد الصوديوم 0.9 ٪ تحت الجلد لمنع إزالة الماء. يتم الاحتفاظ الماوس في الحاضنة للمحافظة على درجة حرارة الجسم حتى يتعافى ، ويتم رصد وزن الماوس 1 يوم ، 1 وبعد اسبوع من الجراحة.
النتائج والمناقشة
صفنا بروتوكول موثوق بها للغاية لأخذ عينات من السائل النخاعي المسلسل من الفئران دون تلوث البلازما كشفها.
1. الإجراء كلها تستغرق عادة 10 دقيقة لكل الماوس (بما في ذلك التخدير). حجم حصلت CSF يعتمد على سلالات الماوس. في الفئران PS / APP تيراغرام مزدوجة كنا 2 ، ومتوسط الحجم حوالي 5 ميكرولتر (3-7 ميكرولتر) ، في حين أن (JNPL3) الفئران P301L 3 تعطي عائدا من حوالي 15 ميكرولتر ميكرولتر 10. لأخذ العينات التسلسلي ، يمكن أن يكون الحد الأقصى ل08/07 ميكرولتر بأمان اتخذت في كل مرة في الفترة الفاصلة من 2-3 أشهر.
2. أثناء الجراحة ، وانه من المهم لوضع الرأس والجسم من الماوس بشكل صحيح على الإطار التجسيمي بحيث يمكن أن يتعرض للجافية من ماجنا صهريج بما فيه الكفاية. تجنب بعناية الأوعية الدموية عند اختراق جافية مع الأنابيب الشعرية لمنع التلوث من بروتينات البلازما ، والتي يمكن رصدها في عينة CSF بواسطة immunoblotting لApoB 4.
3. التقليل من تلف الأنسجة أثناء الجراحة كل أمر مهم ، كما تلازب الأنسجة يمكن أن تزيد من صعوبة عن النزف المهيئة لأخذ العينات التالية.
4. درجة حرارة الجسم يجب أن يكون بحالة جيدة خلال عملية جراحية بسبب انخفاض درجة الحرارة الناجمة عن التخدير يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على مستويات تاو فسفرته في الدماغ بشكل سريع جدا 5.
5. ووصفت إليسا في آب البروتوكول والأجسام المضادة التي كنا بالتفصيل في رينولو آخرون 6. سوف اثنين ميكرولتر من السائل النخاعي من الفئران PS / APP تعطي نتائج مرضية عند 1:50-1:60 المخفف. لELISA تاو ، سيقوم 4-5 CSF ميكرولتر من الفئران (JNPL3) P301L تكون كافية لالكشف عن مجموع تاو ، أو تاو ylated الفوسفور في ثريونين 231 (يتم شراؤها من المصدر أطقم - بيو).
6. ويمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج الماوس الأخرى للأمراض العصبية ، التي كمية صغيرة من السائل النخاعي غير مرضية للفحوصات المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
صفنا بروتوكول موثوق بها للغاية لأخذ عينات من السائل النخاعي المسلسل من الفئران دون تلوث البلازما كشفها.
1. الإجراء كلها تستغرق عادة 10 دقيقة لكل الماوس (بما في ذلك التخدير). حجم حصلت CSF يعتمد على سلالات الماوس. في الفئران PS / APP تيراغرام نقرا نحن used2 ، متوسط حجم حوالي 5 ميكرولتر (3-7 ميكرولتر) ، في حين أن (JNPL3) الفئران P301L 3 تعطي عائدا من حوالي 10 ميكرولتر - 15 ميكرولتر. لأخذ العينات التسلسلي ، يمكن أن يكون الحد الأقصى ل08/07 ميكرولتر بأمان اتخذت في كل مرة في الفترة الفاصلة من 2-3 أشهر.
2. أثناء الجراحة ، فمن المهم لوضع الرأس والجسم من الماوس بشكل صحيح على الإطار التجسيمي بحيث يمكن أن يتعرض للجافية من ماجنا صهريج بما فيه الكفاية. تجنب بعناية الأوعية الدموية عند اختراق جافية مع الأنابيب الشعرية لمنع التلوث من بروتينات البلازما ، والتي يمكن رصدها في عينة CSF بواسطة immunoblotting لApoB 4.
3. التقليل من تلف الأنسجة أثناء الجراحة كل أمر مهم ، كما تلازب الأنسجة يمكن أن تزيد من صعوبة عن النزف المهيئة لأخذ العينات التالية.
4. درجة حرارة الجسم يجب أن يكون بحالة جيدة خلال عملية جراحية بسبب انخفاض درجة الحرارة الناجمة عن التخدير يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على مستويات تاو فسفرته في الدماغ بشكل سريع جدا 5.
5. ووصفت إليسا في آب البروتوكول والأجسام المضادة التي كنا بالتفصيل في رينولو آخرون 6. سوف اثنين ميكرولتر من السائل النخاعي من الفئران PS / APP تعطي نتائج مرضية عند 1:50-1:60 المخفف. لELISA تاو ، 4-5 CSF ميكرولتر من P301L (JNPL3) الفئران سيكون كافيا للكشف عن مجموع تاو ، أو تاو فسفرته في ثريونين 231 (يتم شراؤها من أطقم الحيوية المصدر).
6. ويمكن تطبيق هذه التقنية على نماذج الماوس الأخرى للأمراض العصبية ، التي كمية صغيرة من السائل النخاعي غير مرضية للفحوصات المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ويدعم عملنا والمعاهد الوطنية للصحة منح NS048447 AG017216to دينار كويتي. وليو لى أود أن أشكر الدكتور هايكي Tanila (جامعة كيوبيو ، كيوبيو ، فنلندا) لإشرافه والدعم خلال وضع البروتوكول الأصلي.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
