Summary
ट्रांसजेनिक (टीजी) ई. के माउस मॉडल कैसे और क्यों Aβ या ताऊ स्तर सी.एस.एफ. में परिवर्तन की जांच के रूप में मानव रोगियों में रोग की प्रगति के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करते हैं. यहाँ, हम माउस से धारावाहिक सी.एस.एफ. नमूने के लिए एक परिष्कृत cisterna मैग्ना पंचर तकनीक प्रदर्शित करता है.
Abstract
अल्जाइमर रोग (ई.) एक प्रगतिशील neurodegenerative रोग है कि pathologically β-amyloid पेप्टाइड (Aβ) और hyperphosphorylated ताऊ प्रोटीन का intraneuronal संचय के कोशिकी बयान की विशेषता है है. क्योंकि मस्तिष्कमेरु द्रव (CSF) में मस्तिष्क की बाह्य अंतरिक्ष के साथ सीधे संपर्क में है, यह रोग प्रक्रियाओं के जवाब में मस्तिष्क में जैव रासायनिक परिवर्तन का एक प्रतिबिंब प्रदान करता है. ई. रोगियों से सी.एस.एफ. 42 Aβ (Aβ42) के रूप अमीनो एसिड, और कुल ताऊ और hyperphosphorylated ताऊ में वृद्धि में कमी को दर्शाता है, हालांकि इन परिवर्तनों के लिए जिम्मेदार तंत्र अभी भी पूरी तरह से नहीं समझ रहे हैं. ट्रांसजेनिक (टीजी) ई. के माउस मॉडल कैसे और क्यों Aβ या ताऊ स्तर सी.एस.एफ. बदलने में इस रोग की प्रगति के रूप में जांच के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करते हैं. यहाँ, हम माउस से सी.एस.एफ. नमूने के लिए एक परिष्कृत cisterna मैग्ना पंचर तकनीक प्रदर्शित करता है. यह अत्यंत कोमल नमूना तकनीक धारावाहिक सी.एस.एफ. नमूने 2-3 महीने के अंतराल पर एक ही माउस जो बहुत Aβ या ताऊ के स्तर में भिन्नता के बीच माउस के confounding प्रभाव कम से कम, यह समय पर सूक्ष्म परिवर्तन का पता लगाने के लिए संभव बनाने से प्राप्त की अनुमति देता है. ताऊ और एलिसा Aβ के साथ संयोजन में, इस तकनीक ई. माउस मॉडल में मस्तिष्क में सी.एस.एफ. Aβ42 और ताऊ के स्तर के बीच संबंध और उनके चयापचय की जांच करने के लिए डिज़ाइन अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा. टीजी चूहों में अध्ययन सी.एस.एफ. Aβ या ताऊ स्तर की क्षमता निगरानी रोग प्रगति के लिए जैविक मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया जा के रूप में महत्वपूर्ण मान्यता प्रदान करते हैं, सकता है और उपचारात्मक उपायों के प्रभाव की निगरानी. के रूप में चूहों और बलिदान किया जा सकता है दिमाग जैव रासायनिक या histological परिवर्तन के लिए जांच की जा सकती, सी.एस.एफ. परिवर्तन अंतर्निहित तंत्र को बेहतर मूल्यांकन किया जा सकता है. इन आंकड़ों को मानव ई. सी.एस.एफ. परिवर्तन की व्याख्या के लिए जानकारीपूर्ण होने की संभावना हैं.
Protocol
गिलास केशिका ट्यूब पुलिंग
- गिलास केशिका ट्यूब Sutter साधन इंक (Borosilicate कांच, B100-75-10) से खरीदा है.
- एक Sutter पर पी 87 micropipette डांड़ी गर्मी सेट सूचकांक 300 पर और दबाव सूचकांक 330 पर सेट के साथ ज्वलंत. केशिका ट्यूब खींचो
- कैंची के साथ गिलास केशिका ट्यूब की नोक छाँटो, ताकि पतला टिप के बारे में 0.5 मिमी की एक आंतरिक व्यास है.
सीएसएफ के लिए Cisterna मैग्ना पंचर तकनीक
सी.एस.एफ. नमूने cisterna (चित्रा 1) मैग्ना एक तरीका है कि एक पहले से प्रकाशित किया गया था का उपयोग कर से लिया जाता है. 
चित्रा 1
1. चूहों (100mg/kg) Ketamine और xylazine (10mg/kg), प्रशासित intraperitoneally द्वारा anesthesized हैं. संज्ञाहरण प्रेरण के समय के दौरान, चूहों एक 37 ओ सी इनक्यूबेटर में रखा जाता है.
2. गर्दन की त्वचा के बाल काटे है, और माउस फिर एक हीटिंग पैड के सीधे संपर्क के साथ stereotaxic साधन पर प्रवण रखा है. एक गुदा तापमान जांच मलाशय में डाला जाता है इतना है कि हीटिंग पैड द्वारा उत्पादित गर्मी शरीर के तापमान के बदलाव के जवाब में निकाला जाता है. सिर सिर एडाप्टर के साथ सुरक्षित है. 10% povidone आयोडीन के साथ शल्य साइट swabbed है, 7% 0 इथेनॉल (3 बार दोहराने) द्वारा पीछा किया, और त्वचा के एक बाण के समान चीरा डब करने के लिए अवर किया जाता है .
3. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, चमड़े के नीचे ऊतक और मांसपेशियों (मीटर biventer cervicis मीटर और rectus capitis dorsalis प्रमुख) कुंद विच्छेदन द्वारा संदंश के साथ अलग कर रहे हैं. Microretractors की एक जोड़ी के लिए मांसपेशियों के अलावा पकड़ के लिए प्रयोग किया जाता है.
4. माउस नीचे रखी है कि सिर एक शरीर के साथ लगभग 135 ओ कोण रूपों.
5. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, cisterna मैग्ना के dura मेटर एक चमकदार और स्पष्ट रिवर्स त्रिकोण मज्जा oblongata और एक प्रमुख रक्त वाहिका (arteria dorsalis spinalis), और सी.एस.एफ. अंतरिक्ष के माध्यम से जो दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 2) के रूप में प्रकट होता है. 
चित्रा 2
6. dura मेटर बाँझ कपास झाड़ू के साथ सूखी blotted है. केशिका ट्यूब citerna मैग्ना में dura मेटर, arteria dorsalis spinalis (चित्रा 2) के लिए पार्श्व के माध्यम से घुसना. केशिका ट्यूब प्रविष्टि के प्रतिरोध में एक महत्त्वपूर्ण बदलाव के बाद, सी.एस.एफ. केशिका ट्यूब में बहती है.
7. ध्यान केशिका ट्यूब निकालने के लिए, और एक 3 मिलीलीटर सिरिंज के लिए यह एक polyethylene टयूबिंग है कि एक 1 मिमी आंतरिक व्यास के माध्यम से कनेक्ट. एक पूर्व चिह्नित 0.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में सी.एस.एफ. इंजेक्षन, और ट्यूब तुरंत सूखी बर्फ पर फ्रीज और तब यह एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानान्तरण.
8 सी.एस.एफ. नमूने के बाद, मांसपेशियों फिर से जुड़ रहे हैं, और त्वचा (4-0, Ethicon, जॉनसन एंड जॉनसन) sutured है. 0.9% NaCl के बारे में 1 मिलीलीटर इंजेक्शन subcutaneously है de-जलयोजन को रोकने. माउस इनक्यूबेटर में रखा जाता है शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए जब तक यह ठीक है, माउस का वजन 1 दिन, और सर्जरी के बाद 1 सप्ताह नजर रखी है.
परिणाम और चर्चा
हम detectable प्लाज्मा संदूषण के बिना चूहों से सी.एस.एफ. के धारावाहिक नमूने के लिए एक अत्यंत विश्वसनीय प्रोटोकॉल का वर्णन.
1. पूरी प्रक्रिया आम तौर पर माउस प्रति 10 मिनट (संज्ञाहरण सहित) लेता है. सी.एस.एफ. प्राप्त की मात्रा माउस उपभेदों पर निर्भर है. PS / एपीपी डबल टीजी चूहों हम 2 इस्तेमाल में, औसत मात्रा के बारे में 5 μl (3 से 7 μl) है, जबकि P301L (JNPL3) 3 चूहों के बारे में 10 μl-15 μl की उपज दे. नमूने के लिए धारावाहिक, 7-8 μl की एक अधिकतम सुरक्षित रूप से 2-3 महीनों के अंतराल पर किया जा सकता है हर बार लिया.
2. शल्य चिकित्सा के दौरान, यह महत्वपूर्ण है शरीर और माउस के सिर ठीक से stereotaxic फ्रेम पर इतना है कि cisterna मैग्ना के dura मेटर पर्याप्त उजागर किया जा सकता है स्थिति. ध्यान से रक्त वाहिकाओं से बचने जब केशिका ट्यूब प्लाज्मा प्रोटीन है, जो 4 ApoB लिए immunoblotting सी.एस.एफ. नमूने में नजर रखी जा सकती से प्रदूषण को रोकने के साथ dura मेटर मर्मज्ञ.
3. प्रत्येक सर्जरी के दौरान ऊतकों को नुकसान कम से कम महत्वपूर्ण है, ऊतक conglutination के रूप में निम्न नमूना लेने के लिए खून बह रहा predisposing द्वारा कठिनाई में वृद्धि कर सकते हैं.
4. शरीर के तापमान को अच्छी तरह से सर्जरी के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए क्योंकि संज्ञाहरण की वजह से हाइपोथर्मिया काफी मस्तिष्क में phosphorylated ताऊ का स्तर बहुत 5 तेजी से प्रभावित कर सकते हैं.
5. अब एलिसा प्रोटोकॉल और एंटीबॉडी है कि हम इस्तेमाल Refolo एट अल में विस्तार में वर्णित किया गया 6.. PS / एपीपी चूहों से दो सी.एस.एफ. की μl संतोषजनक परिणाम दे जब 1:50-1:60 पतला होगा. ताऊ एलिसा के लिए, 4-5 P301L चूहों (JNPL3) से μl सी.एस.एफ. के लिए पर्याप्त होगाकुल ताऊ, या ताऊ का पता लगाने भास्वर threonine पर ylated 231 (किट जैव स्रोत से खरीद रहे हैं).
6. इस तकनीक को अन्य स्नायविक रोगों, जिसके लिए सी.एस.एफ. की एक छोटी मात्रा वांछित assays के लिए संतोषजनक है माउस मॉडल को लागू किया जा सकता है.
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Discussion
हम detectable प्लाज्मा संदूषण के बिना चूहों से सी.एस.एफ. के धारावाहिक नमूने के लिए एक अत्यंत विश्वसनीय प्रोटोकॉल का वर्णन.
1. पूरी प्रक्रिया आम तौर पर माउस प्रति 10 मिनट (संज्ञाहरण सहित) लेता है. सी.एस.एफ. प्राप्त की मात्रा माउस उपभेदों पर निर्भर है. PS / एपीपी डबल टीजी चूहों used2 हम में औसत मात्रा के बारे में 5 μl (3 से 7 μl) है, जबकि P301L (JNPL3) 3 चूहों के बारे में 10 μl 15 μl की उपज दे. नमूने के लिए धारावाहिक, 7-8 μl की एक अधिकतम सुरक्षित रूप से 2-3 महीनों के अंतराल पर किया जा सकता है हर बार लिया.
2. शल्य चिकित्सा के दौरान, यह महत्वपूर्ण है शरीर और माउस के सिर ठीक से stereotaxic फ्रेम पर इतना है कि cisterna मैग्ना के dura मेटर पर्याप्त उजागर किया जा सकता है स्थिति. ध्यान से रक्त वाहिकाओं से बचने जब केशिका ट्यूब प्लाज्मा प्रोटीन है, जो 4 ApoB लिए immunoblotting सी.एस.एफ. नमूने में नजर रखी जा सकती से प्रदूषण को रोकने के साथ dura मेटर मर्मज्ञ.
3. प्रत्येक सर्जरी के दौरान ऊतकों को नुकसान कम से कम महत्वपूर्ण है, ऊतक conglutination के रूप में निम्न नमूना लेने के लिए खून बह रहा predisposing द्वारा कठिनाई में वृद्धि कर सकते हैं.
4. शरीर के तापमान को अच्छी तरह से सर्जरी के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए क्योंकि संज्ञाहरण की वजह से हाइपोथर्मिया काफी मस्तिष्क में phosphorylated ताऊ का स्तर बहुत 5 तेजी से प्रभावित कर सकते हैं.
5. अब एलिसा प्रोटोकॉल और एंटीबॉडी है कि हम इस्तेमाल Refolo एट अल में विस्तार में वर्णित किया गया 6.. PS / एपीपी चूहों से दो सी.एस.एफ. की μl संतोषजनक परिणाम दे जब 1:50-1:60 पतला होगा. ताऊ एलिसा, 4-5 P301L (JNPL3) से μl सी.एस.एफ. चूहों कुल ताऊ का पता लगाने के के लिए पर्याप्त होगा, या ताऊ threonine 231 पर phosphorylated के लिए (किट जैव स्रोत से खरीद रहे हैं).
6. इस तकनीक को अन्य स्नायविक रोगों, जिसके लिए सी.एस.एफ. की एक छोटी मात्रा वांछित assays के लिए संतोषजनक है माउस मॉडल को लागू किया जा सकता है.
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Acknowledgments
हमारा काम NIH अनुदान NS048447 और AG017216to केडी द्वारा समर्थित है. ली लियू अपने पर्यवेक्षण और समर्थन के लिए मूल प्रोटोकॉल के विकास के दौरान डा. Heikki Tanila (क्वॉपिया, क्वॉपिया, फिनलैंड विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहूंगा.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
