Summary
Трансгенные (Tg) мышиных моделях AD предоставит прекрасную возможность для исследования, как и почему Ар или тау уровней изменения ликвора по мере прогрессирования заболевания в человеческих пациентов. Здесь мы демонстрируем, изысканный цистерны Magna прокол техника для последовательного отбора проб СМЖ от мыши.
Abstract
Болезнь Альцгеймера (БА) является прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется патологически внеклеточной отложение β-амилоида пептида (Ар) и intraneuronal накопления hyperphosphorylated тау-протеина. Из спинномозговой жидкости (ликвора) находится в непосредственном контакте с внеклеточном пространстве мозга, он обеспечивает отражение биохимических изменений в головном мозге в ответ на патологические процессы. СМЖ от больных AD показывает снижение 42 аминокислотных форме Ар (Aβ42) и увеличение в общем объеме тау-тау и hyperphosphorylated, хотя механизмы, ответственные за эти изменения до сих пор полностью не поняты. Трансгенные (Tg) мышиных моделях AD предоставит прекрасную возможность для исследования, как и почему Ар или тау уровней изменения ликвора, как болезнь прогрессирует. Здесь мы демонстрируем, изысканный цистерны Magna прокол методика отбора проб СМЖ от мыши. Это очень нежный выборки техника позволяет серийные образцы спинномозговой жидкости, которые будут получены из того же мыши на 2-3 интервалами месяц, что значительно минимизирует влияние смешанных между мыши изменчивости в Ар или тау уровней, позволяющих обнаружить тонкие изменения с течением времени. В сочетании с Ар и тау-ELISA, эта методика будет полезна для исследований, направленных на изучение взаимосвязи между уровнем CSF Aβ42 и тау, и их обмен веществ в мозге в модели AD мыши. Исследования в Tg мышей может дать важную проверку, чтобы потенциал CSF Ар или тау уровнях, которые будут использованы в качестве биологических маркеров для мониторинга прогрессирования заболевания, а также для мониторинга влияния терапевтических вмешательств. Как мыши могут быть принесены в жертву и мозги могут быть проверены на предмет биохимических или гистологических изменений, механизмы, лежащие в ликворе изменения могут быть лучше оценены. Эти данные, вероятно, будут информативными для интерпретации человеческой изменения ликвора нашей эры.
Protocol
Тяговая стекла капиллярная трубка
- Стеклянная капиллярная трубка закупается у Саттера Инструмент Inc (боросиликатного стекла, B100-75-10).
- Вытяните капилляров на Саттер Р-87 Flaming микропипетки съемник, с тепловой индекс установлен на уровне 300 и индексу давления, установлен на уровне 330.
- Обрезать кончик стеклянной капиллярной трубке с ножницами, так что конические наконечник имеет внутренний диаметр около 0,5 мм.
Cisterna Magna прокол методика CSF
CSF образцы взяты из цистерны Magna (рис. 1) с помощью метода, который был опубликован ранее 1. 
Рисунок 1
1. Мышей anesthesized по Кетамин (100mg/kg) и ксилазина (10mg/kg), вводили внутрибрюшинно. Во время наркоза индукция, мышей находятся в 37 ° С инкубатор.
2. Кожа шеи побрился, и мышь помещается ничком на стереотаксического прибора при прямом контакте грелку. Ректального датчика температуры вводится в прямую кишку так, чтобы тепло от грелки корректируется в ответ на изменения температуры тела. Голова крепится с главой адаптеров. Хирургических сайт протереть с 10% повидон йодом, а затем 7 0% этанола (повторите 3 раза), и сагиттальной разрез кожи производится уступает затылка.
3. Под микроскопом рассечение, подкожной клетчатки и мышц (m. двубрюшная мышца cervicis и m. прямая волосистой части головы спинной мажор) разделяются тупым рассечение щипцами. Пара microretractors используется для хранения мышцы друг от друга.
4. Мышь закреплено так, чтобы голова формы почти 135 о угла с телом.
5. Под микроскопом рассечение, твердой мозговой оболочки из цистерны Magna выглядит как блестящее и ясное обратный треугольник, через который продолговатого мозга и основных кровеносных сосудов (артерии остистой спинной), а пространство CSF видны (рис. 2). 
Рисунок 2
6. Твердой мозговой оболочки стирается сухой стерильной ватной палочкой. Проникнуть в капиллярной трубке Citerna Magna через твердую мозговую оболочку, латеральнее артерии остистой спинной (рис. 2). После заметного изменения сопротивления капиллярной трубке вставки, CSF впадает в капиллярной трубке.
7. Осторожно снимите капиллярная трубка, и подключить его к 3 мл шприцем через полиэтиленовый трубопровод, который 1 мм, внутренний диаметр. Inject CSF в заранее заполненных 0,5 мл трубки Эппендорф, и заморозить трубку сразу же на сухом льду, а затем передать его в морозильной камере -80 ° C.
8. После отбора проб спинномозговой жидкости, мышцы реорганизовывались и кожи зашивается (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Около 1 мл 0,9% NaCl вводят подкожно для предотвращения обезвоживания. Мышь хранится в инкубаторе для поддержания температуры тела, пока не восстанавливается; вес мыши контролируется 1 день и 1 неделю после операции.
Результаты и обсуждение
Мы описали высоконадежный протокол для последовательного отбора проб спинномозговой жидкости у мышей без выявляемых загрязнения плазмы.
1. Вся процедура обычно занимает 10 минут на мышь (включая анестезию). Объем СМЖ получены зависит от мыши штаммов. В PS / АПП двойной Tg мышей мы использовали 2, средний объем составляет около 5 мкл (от 3 до 7 мкл), в то время P301L (JNPL3) мышей 3 дают урожай около 10 мкл 15 мкл. Для последовательного отбора проб, максимум 7-8 мкл можно безопасно принимать каждый раз с интервалом в 2-3 месяца.
2. Во время операции, важно, чтобы положение головы и тела мыши должным образом на стереотаксической кадр так, чтобы твердой мозговой оболочки из цистерны Magna могут подвергаться достаточно. Тщательно избегать кровеносных сосудов при проникающих твердой мозговой оболочки с капиллярной трубке, чтобы предотвратить заражение от белков плазмы, который можно наблюдать в образце CSF с помощью метода иммуноблоттинга для АроВ 4.
3. Сведение к минимуму повреждения тканей во время каждой операции важно, так как ткани склеивания может увеличить трудность, предрасполагающих кровотечение на следующий выборки.
4. Температура тела должна быть хорошо сохраняется в течение операцию из-за переохлаждения вызвано анестезии может значительно повлиять на уровни фосфорилированных тау в мозг очень быстро 5.
5. Ab ИФА протокол и антитела, которые мы использовали, были подробно описаны в Рефоло и соавт. 6. Два мкл спинномозговой жидкости из PS / APP мышей даст удовлетворительные результаты при разведении 1:50-1:60. Для тау ELISA, 4-5 мкл спинномозговой жидкости из P301L (JNPL3) мышей будет достаточно длявыявление общего тау, или тау люминофор ylated на треонин 231 (комплекты приобретаются у Био-Source).
6. Эта техника может быть применена к другим моделям мыши неврологических болезней, для которых небольшой объем СМЖ является удовлетворительным для желаемых анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали высоконадежный протокол для последовательного отбора проб спинномозговой жидкости у мышей без выявляемых загрязнения плазмы.
1. Вся процедура обычно занимает 10 минут на мышь (включая анестезию). Объем СМЖ получены зависит от мыши штаммов. В PS / АПП двойной Tg мышей мы used2, средний объем составляет около 5 мкл (от 3 до 7 мкл), в то время P301L (JNPL3) мышей 3 дают урожай около 10 мкл 15 мкл. Для последовательного отбора проб, максимум 7-8 мкл можно безопасно принимать каждый раз с интервалом в 2-3 месяца.
2. Во время операции, важно, чтобы положение головы и тела мыши должным образом на стереотаксической кадр так, чтобы твердой мозговой оболочки из цистерны Magna могут подвергаться достаточно. Тщательно избегать кровеносных сосудов при проникающих твердой мозговой оболочки с капиллярной трубке, чтобы предотвратить заражение от белков плазмы, который можно наблюдать в образце CSF с помощью метода иммуноблоттинга для АроВ 4.
3. Сведение к минимуму повреждения тканей во время каждой операции важно, так как ткани склеивания может увеличить трудность, предрасполагающих кровотечение на следующий выборки.
4. Температура тела должна быть хорошо сохраняется в течение операцию из-за переохлаждения вызвано анестезии может значительно повлиять на уровни фосфорилированных тау в мозг очень быстро 5.
5. Ab ИФА протокол и антитела, которые мы использовали, были подробно описаны в Рефоло и соавт. 6. Два мкл спинномозговой жидкости из PS / APP мышей даст удовлетворительные результаты при разведении 1:50-1:60. Для тау ELISA, 4-5 мкл спинномозговой жидкости из P301L (JNPL3) мышей будет достаточно для выявления общего тау, или тау-фосфорилированных на треонин 231 (комплекты приобретаются у Био-Source).
6. Эта техника может быть применена к другим моделям мыши неврологических болезней, для которых небольшой объем СМЖ является удовлетворительным для желаемых анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Наша работа поддерживается грантами NIH NS048447 и AG017216to KD. Лю Ли хотел бы поблагодарить доктора Хейкки Tanila (Университет Куопио, Куопио, Финляндия) за руководство и поддержку в развитии оригинального протокола.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
