Summary
(Tg) AD transgenik fare modelleri, nasıl ve neden Aβ veya tau düzeyleri BOS değişikliği insan hastalarda hastalık ilerledikçe araştırmak için mükemmel bir fırsat sağlar. Burada, fare seri BOS örnekleme için rafine bir sisterna magna ponksiyonu tekniği göstermektedir.
Abstract
Alzheimer hastalığı (AH) patolojik, beta-amiloid peptid (Aβ) ve hyperphosphorylated tau proteininin intraneuronal birikimi ekstrasellüler birikimi ile karakterize ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır. Beyin omurilik sıvısı (BOS) beynin ekstraselüler boşluk ile doğrudan temas halinde olduğundan, patolojik süreçler yanıt olarak beyindeki biyokimyasal değişikliklerin bir yansıması sağlar. AD hastalardan alınan BOS, bu değişiklikler için sorumlu olan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılmış değildir ama 42 amino asit formu Aβ (Aβ42) ve total tau ve hyperphosphorylated tau artışlar bir azalma gösterir. (Tg) AD transgenik fare modelleri Aβ veya tau düzeyleri BOS değişiklik neden ve nasıl hastalık ilerledikçe araştırmak için mükemmel bir fırsat sağlar. Burada, fare BOS örnekleme için rafine bir sisterna magna ponksiyonu tekniği göstermektedir. Bu son derece nazik bir örnekleme tekniği seri BOS örnekleri zamanla ince değişiklikleri tespit etmek mümkün kılan büyük ölçüde, fare Aβ veya tau düzeyleri arasında değişkenlik karıştırıcı etkisini en aza indirir 2-3 aylık aralıklarla aynı fare elde edilecek sağlar. Aβ ve tau ELISA ile birlikte, bu tekniğin AD fare modelleri, beyin, BOS Aβ42 ve tau düzeyleri arasındaki ilişki ve onların metabolizmasını araştırmak için tasarlanmış çalışmalar için yararlı olacaktır. Tg fareler üzerinde yapılan çalışmalar, hastalığın ilerlemesi izlenmesi için biyolojik belirteç olarak kullanılmak üzere BOS Aβ veya tau düzeyleri potansiyel olarak önemli bir doğrulama sağlayabilir ve tedavi edici girişimlerin etkisi izlemek için. , Farelerin feda edilebilir ve beyinlerinde biyokimyasal ve histolojik değişiklikler için incelenecektir gibi, BOS değişikliklerin altında yatan mekanizmaları daha iyi değerlendirilebilir. Bu veriler insan AD BOS değişiklikleri yorumlanması için bilgilendirici olması muhtemeldir.
Protocol
Çekme cam kapiller tüp
- Cam kapiller tüp Sutter Enstrüman A.Ş. (borosilikat cam, B100-75-10) satın alınmaktadır.
- Kılcal tüpler çekin bir Sutter P-87, 300 ayarlanan ısı indeksi ve 330 olarak belirlenmiştir basınç indeksi, mikropipet çektirmesi Flaming.
- Sivri ucu yaklaşık 0.5 mm iç çapa sahip, böylece cam kapiller tüp ucu makas ile kesin.
CSF Cisterna magna ponksiyonu tekniği
BOS örnekleri sisterna magna (Şekil 1), daha önce 1 yayımlandı bir yöntem kullanarak alınır. 
Şekil 1
1. Fareler Ketamin (100mg/kg) ve xylazine (10mg/kg) intraperitoneal yolla anesthesized. Anestezi indüksiyonu sırasında, fareler 37 o C inkübatör tutulur.
2. Boyun derisi traş ve fare sonra bir ısıtma yastığı doğrudan temas ile stereotaksik alet eğilimli yerleştirilir. Isıtma yastığı tarafından üretilen ısı, vücut ısısı değişikliklerine yanıt olarak ayarlanır, böylece bir rektal ısı probu rektum içine yerleştirilir. Kafa kafa adaptörleri ile güvence altına alınmıştır. 7 0% etanol (3 kez tekrarlamanız), cerrahi sitesi% 10 povidon iyot ile temizlenmesi, ve oksiput aşağı cilt sagital bir kesi yapılır.
3. Diseksiyon mikroskobu altında, subkutan doku ve kasları (m. biventer cervicis ve m. rektus kapitis dorsalis majör) künt diseksiyon forseps ile ayrılır. Microretractors bir çift dışında kaslar tutmak için kullanılır.
4. Fare kafası, gövdesi ile yaklaşık 135 o açı oluşturur, böylece ortaya konulmaktadır .
5. Diseksiyon mikroskobu altında, sisterna magna duramater medulla oblongata ve büyük bir kan damarı (arteria dorsalis spinalis) ve BOS alanı (Şekil 2) görünür olan bir parlak ve net bir ters üçgen gibi görünür. 
Şekil 2
6. Duramater steril pamuklu bir bez ile kuru lekelenen. Arteria dorsalis spinalis (Şekil 2) Lateral duramater, kılcal tüp aracılığıyla citerna magna içine nüfuz ederler. Kılcal boru ekleme direnç farkedilir bir değişikliğin ardından, BOS kılcal tüp içine akar.
7. Kılcal tüp dikkatlice çıkarın ve 1 mm iç çapı olan bir polietilen boru ile 3 ml şırınga bağlayın. BOS önceden işaretli 0.5 ml Eppendorf tüp içine enjekte edilir ve tüp dondurma ve kuru buz üzerinde hemen sonra -80 ° C derin dondurucu içine transfer.
8. BOS örnekleme sonra, kasların yeniden hizalanır ve cilt sütüre edilir (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Yaklaşık 1 ml% 0.9 NaCl de-hidrasyon önlemek için subkutan enjekte edilir. Fare kurtarır kadar vücut ısısını korumak için inkübatör tutulur; farenin ağırlığı 1 gün ve 1 hafta sonra ameliyat izlenir.
Sonuçlar ve Tartışma
Biz saptanabilir plazma kirlenme olmadan farelerden alınan BOS seri örnekleme için son derece güvenilir bir protokol nitelendirdi.
1. Tüm prosedür genellikle fare başına 10 dakika (anestezi dahil) alır. BOS elde hacmi fare suşları bağlıdır. P301L (JNPL3) farelerde 3 yaklaşık 10 ul-15 ul verimi verirken, biz 2 PS / APP çift Tg fareler ortalama hacmi, yaklaşık 5 ul (3 7 ul). Seri numune almak için, en fazla 7-8 ul bir güvenle 2-3 ay aralıklarla her zaman olabilir.
2. Ameliyat sırasında, sisterna magna duramater yeterince maruz böylece stereotaksik çerçeve düzgün fare baş ve vücut pozisyonu önemlidir. ApoB 4 immunoblotting BOS örnek izlenebilir plazma proteinlerine, kirlenmeyi önlemek için kapiller tüp ile duramater nüfuz kan damarlarını dikkatle kaçının.
3. Doku kaynama Aşağıdaki örnekleme için predispozan kanama zorluk artışı gibi her ameliyat sırasında doku hasarı en aza indirmek önemlidir.
4. Hipotermi anestezi nedeniyle önemli ölçüde beyin çok hızlı bir şekilde 5 fosforile tau düzeyleri etkileyebilir, çünkü vücut ısısı ameliyat sırasında iyi bir bakıma ihtiyacı vardır.
5. Kullanılan Ab ELISA protokolü ve antikorlar Refolo ark ayrıntılı şekilde tarif edildi. 6. İki PS / APP farelerden alınan BOS ul 1:50-1:60 seyreltilmiş zaman tatmin edici sonuçlar verecektir. Tau ELISA için 4-5 ul P301L (JNPL3) farelerden alınan BOS için yeterli olacaktırtoplam tau tau tespit fosfor treonin az ylated 231 (Bio-Kaynak Kitleri satın alınır).
6. Bu teknik, küçük bir BOS hacmi istenilen deneyleri için tatmin edici olduğu nörolojik hastalıklar, diğer fare modelleri uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz saptanabilir plazma kirlenme olmadan farelerden alınan BOS seri örnekleme için son derece güvenilir bir protokol nitelendirdi.
1. Tüm prosedür genellikle fare başına 10 dakika (anestezi dahil) alır. BOS elde hacmi fare suşları bağlıdır. P301L (JNPL3) farelerde 3 ul ul-10 15 verim verirken biz used2 PS / APP çift Tg fareler, ortalama hacmi, yaklaşık 5 ul (3 7 ul). Seri numune almak için, en fazla 7-8 ul bir güvenle 2-3 ay aralıklarla her zaman olabilir.
2. Ameliyat sırasında, sisterna magna duramater yeterince maruz böylece stereotaksik çerçeve düzgün fare baş ve vücut pozisyonu önemlidir. ApoB 4 immunoblotting BOS örnek izlenebilir plazma proteinlerine, kirlenmeyi önlemek için kapiller tüp ile duramater nüfuz kan damarlarını dikkatle kaçının.
3. Doku kaynama Aşağıdaki örnekleme için predispozan kanama zorluk artışı gibi her ameliyat sırasında doku hasarı en aza indirmek önemlidir.
4. Hipotermi anestezi nedeniyle önemli ölçüde beyin çok hızlı bir şekilde 5 fosforile tau düzeyleri etkileyebilir, çünkü vücut ısısı ameliyat sırasında iyi bir bakıma ihtiyacı vardır.
5. Kullanılan Ab ELISA protokolü ve antikorlar Refolo ark ayrıntılı şekilde tarif edildi. 6. İki PS / APP farelerden alınan BOS ul 1:50-1:60 seyreltilmiş zaman tatmin edici sonuçlar verecektir. Treonin 231 fosforile tau ELISA, fareler toplam tau tespiti için yeterli olacaktır P301L (JNPL3) 4-5 ul BOS, ya da tau (Kitleri Bio-Kaynak satın alınır).
6. Bu teknik, küçük bir BOS hacmi istenilen deneyleri için tatmin edici olduğu nörolojik hastalıklar, diğer fare modelleri uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Çalışmalarımız NIH hibe NS048447 ve AG017216to KD tarafından desteklenmektedir. Li Liu orijinal protokol gelişimi sırasında Dr. Heikki Tanila (Kuopio Üniversitesi, Kuopio, Finlandiya) onun gözetimi ve desteği için teşekkür etmek istiyorum.
References
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97 (1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229 (2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090 (2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890 (2001).
