Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp

Summary

Ceci est un guide pour modifier la forme de micropipettes de verre. Plus précisément, en utilisant la chaleur et la pression d'air du cône est élargi sans pour autant augmenter l'ouverture astuce, conduisant à une plus faible résistance pipette. Cela est essentiel pour obtenir des enregistrements à faible bruit de petites cellules, mais est utile dans de nombreuses applications.

Abstract

Pression de polissage est une méthode pour façonner des pipettes en verre pour patch-clamp. Nous avons d'abord développé cette méthode pour la fabrication de pipettes approprié pour l'enregistrement de petite taille (<3 m) des corps cellulaires neuronaux. Le principe de base est similaire à soufflage du verre et combine la pression de l'air et la chaleur de modifier la forme de pipettes de patch préparé par un extracteur micropipette conventionnels. Il peut être appliqué aux soi-disant douces (chaux sodée) et durs (borosilicate) lunettes. De manière générale le polissage de pression, peut réduire la résistance pipette de 25% sans diminuer le diamètre de l'ouverture pointe (Goodman et Lockery, 2000). Il peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type de verre et ne nécessite que l'ajout d'une vanne à haute pression et à équiper une microforge. Cette technique est indispensable pour l'enregistrement à partir des cellules ultrapetites (<5 m) et peut également améliorer canal unique d'enregistrement en minimisant la résistance pipette. La forme émoussée est également utile pour l'enregistrement de pince-patch perforé puisque cette forme de la pointe des résultats dans une bulle plus grande membrane disponible pour la perforation.

Protocol

Pipettes de traction

En utilisant un filament extracteur comme une Sutter P-97 Extracteur microélectrodes Flaming / Brown, tirer un ensemble d'environ 10-20 pipettes.

1. Sélectionnez votre verre. Nous utilisons borosilicate (BF150-86-10, DO = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Conservez le verre avec soin afin qu'il reste propre et sans poussière.
2. Concevoir un programme de traction. L'objectif principal est une astuce ouverture d'environ la taille désirée, ce qui dépendra de l'application. Sutter P-97 Cookbook Pipeter ² est une excellente référence.
3. Observez vos pipettes sous un microscope pour déterminer le diamètre d'ouverture et de douceur. Jeter rugueux, inégaux des conseils, ou irrégulière. Pour l'enregistrement de patch-clamp standard, une ouverture astuce qui est de 2-4 um travers est le meilleur. Une pointe émoussée conduit à diminuer la résistance pour le diamètre de la même ouverture, qui est préférée. La forme et la taille peuvent être modifiés au cours du polissage, ci-dessous.

Pipettes de polissage de pression

1. Joindre un porte-pipette à une ligne propre, l'air comprimé. L'utilisation d'un régulateur, réglez la pression de l'air comprimé en ligne à ~ 40 PSI. Connectez la ligne d'air comprimé pour une vanne de régulation à 4 voies qui permettront la pression porte-pipette à être allumé et éteint. Connecter un porte-pipette à la valve de contrôle d'une longueur de ⅛ de tube Tygon ®.
2. Utiliser un appareil de polissage (microforge) avec un porte-pipette à haute pression, une bobine de polissage contrôlé par une pédale, un microscope équipé d'un grossissement faible et élevé, longue distance de travail (idéalement, 10x et 100x) de l'air objectifs. Il est essentiel d'être capable d'observer l'ouverture pipette pendant le protocole.
3. En option: Manteau de la pipette avec un isolant hydrophobe pour diminuer la capacité et améliorer les caractéristiques du bruit (voir «Tirer les pipettes" pour cette technique).
4. Vérifiez la soupape de pression est en position off. Placer une pipette dans le porte-pipette et serrer le raccord au doigt serrés.
   
   Note de sécurité: Si la pipette est tenu fermement dans le porte-pipette, la pression d'air causera la pipette d'être éjecté du porte-pipette.
   
   
5. Placez la pipette et titulaire de la microforge. Placez le porte-pipette sur la platine du microscope de telle sorte que la pointe et la bobine de polissage sont visibles à faible (10x) de puissance sur le microforge. Apportez la pointe ~ 75 microns à partir du filament. Gardez à l'esprit que le filament se développer lorsqu'il est chauffé.
6. Passez à l'alimentation (100x) objectif élevé. Tant la pointe de la pipette et la bobine de polissage doit être mise au point et dans le champ de vision. Sinon, ajustez la hauteur de la bobine de polissage. (Position de la pipette ne peut pas être ajusté). La pointe de la pipette et la bobine de polissage devrait être proche de deux côtés opposés du champ de vue. Evitez de placer la bobine trop près de la pointe de la pipette, car elle augmentera à mesure que ça chauffe et bosse dans votre pipette.
7. Tournez la vanne pour diriger l'air comprimé dans la pipette, et la chaleur de la pointe de la pipette jusqu'à ce que le cône derrière la pointe commence à ballon vers l'extérieur.
8. Arrêter le chauffage avant la pointe des ballons trop intensivement. L'expérimentation est nécessaire pour déterminer la distance appropriée, la chaleur et du temps pour la forme désirée.
9. En option: Réduire le diamètre d'ouverture pointe en polissant la pointe en l'absence de pression. Les étapes 7 et 8 peuvent répétée pour affiner la fois la forme et les dimensions de l'embout de la pipette.
10. Eteindre la pression et tout en pointant l'extrémité de la pipette dans une direction sûre, retirer la pipette et le placer dans une boîte de stockage propre, où il sera protégé de la poussière.
    
    Note de sécurité: Si la pression de l'air n'est pas éteint, la pipette peut être éjecté du porte-pipette lors du retrait.

Remarques sur les microforge

Nous utilisons un microforge assemblés à partir de hors-the-shelf pièces disponibles dans le commerce. (Vous pouvez également acheter un kit de pression de polissage de quelques sociétés, par exemple, ALA Science, GlassWorx). Indépendamment de la microforge, il est essentiel d'avoir l'optique qui sont assez bons pour voir l'ouverture pointe, ce qui n'est souvent que quelques um de diamètre. Nous utilisons une lentille longue distance de travail 100x à cet effet. Aussi, le manteau de la bobine de polissage de verre à haute température de fusion, afin de minimiser le dépôt de métal vaporisé sur les pipettes.

Partie 3: Résultats attendus

Polir pression modérée peut réduire la résistance d'une pipette sans un changement appréciable dans l'ouverture de diamètre. Si désiré, ce protocole peut être utilisé pour faire des pipettes avec sub-micron ouvertures et résistances entre 5-10MΩ.

Discussion

Nous avions d'abord développé cette méthode pour faire des pipettes utile pour patch-clamp 2-3 um neurones en C. elegans ^1. C'est dans l'utilisation de routine dans le laboratoire de Goodman. Pipettes pression polonaise Nous avons non seulement pour l'enregistrement à partir de minuscules C. neurones elegans, mais aussi pour l'obtention d'enregistrements macropatch et un seul canal des canaux ioniques exprimés dans des ovocytes de Xenopus. Pour une donnée pointe de l'ouverture de diamètre, la forme émoussée produit d'une pipette à faible résistance. Plus faible résistance à la pipette conduit à une plus faible résistance série et à faible bruit des enregistrements.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Glass Capillaries	Consumable	Sutter Instrument Co.	BF150-85-10 (or similar)	The method works with any type of capillary except those made from quartz. However, we recommend using capillaries with a filament.
Inverted Microscope	Microscope	Leica Microsystems	DM IL (or similar)	Any simple inverted microscope will do. However, it is essential to have sufficient magnification to see pipettes during polishing. We use a 100x metallurgical lens with a long working distance for this purpose.
Microforge Kit	Tool	ALA Science	CPM-2	Supplies polishing coil, controller and foot pedal.
Air pressure source	Tool	ALA Science	PR-60	Accessory for providing high pressure, includes a suitable valve. Alternatively, compressed air from the building can be used together with a filter/regulator (set to 40 PSI) and a 4-way valve (see below)
4-way valve	Tool	Cole-Parmer	A-98150-01	Fittings will be needed to couple valve to tubing
Pipette Holder with Luer Connector	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH-6S20	Use a male luer-to-barb fitting to connect pipette holder to high-pressure tubing
Tygon® tubing	Tool	Cole-Parmer	06408-62	Use this tubing to connect pipette holder to 4-way valve