Summary
זהו פרוטוקול המתאר כיצד לבודד תרבות נוירונים אוהד העיקרי של הגנגליונים צוואר הרחם מעולה (SCG) של גורי חולדה היילוד.
Abstract
הגרעינים צוואר הרחם מעולה (SCG) אצל חולדות הם קטנים, מבריק, דמוי שקד מבנים המכילים נוירונים אוהד. נוירונים אלה מספקים innervations אוהד לראש ואזורים הצוואר והם מהווים אוכלוסייה היטב מאופיין והומוגני יחסית (4). נוירונים הסימפתטית תלויים בגורם גדילה עצבי (NGF) לצמיחה, הישרדות בידול axonal והתפשטות רחבה הזמינות של NGF מקלה תרבותם מניפולציה ניסויית (2, 3, 6). מסיבות אלה, נוירונים בתרבית אוהד כבר בשימוש במגוון רחב של מחקרים כולל פיתוח בידול עצב, מנגנונים של מות תאים מתוכנת ופתולוגיים, ואת הולכת אותות (1, 2, 5, 6). לנתח את SCG מן החולדות יומו נוירונים culturing אוהד לא מאוד מסובך וניתן לשלוט די מהר. במאמר זה נתאר בפירוט כיצד לנתח את SCG מ גורים עכברוש היילוד להשתמש בהם כדי להקים תרבויות של נוירונים אוהד. המאמר כמו כן נתאר את הצעדים ההכנה ואת ריאגנטים שונים וציוד הנחוצים כדי להשיג זאת.
Protocol
1. הכנה לניתוח:
- בחר את המנה המתאימה תרבות (10 ס"מ או 6 צלחות, או גם 24 טוב, וכו ') בהתאם לאופי הניסויים שלך, מעיל אותם עם זנב עכברוש 24 שעות לפני קולגן לנתיחה. שיטות להכנת עכברוש זנב קולגן ושימוש בו כדי המנות תרבות מעיל תוארו במקום אחר (1).
- הכן פתרון טריפסין 0.25% ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) (ללא EDTA) ולסנן לעקר. הכן 1 aliquots מ"ל ולאחסן ב -20 º C.
- הכן תמיסה המכילה 2.5 מ"מ כל אחד uridine ו-5-FDU ב מזוקקים / deionized H 2 O. מסנן לעקר ולהכין 50 aliquots μl. חנות ב -20 º C.
- הכן בינוני השלם: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 10% נסיוב סוס (חום להשבית ידי דוגרים על 56 º C waterbath במשך 30 דקות) ו -5% בסרום שור העובר.
- הכן בינוני סופי: RPMI 1640 בינוני התרבות עם חום מומת 1% סוס סרום + NGF (ריכוז 100ηg/ml הסופי) + פניצילין / סטרפטומיצין (1 / 250) + 1 / 250 פתרון uridine/5-FDU (10 מיקרומטר הריכוז הסופי) . הערה: זה צריך להיות בינוני מורכב טרי לפני השימוש בכל פעם. לצורך ניסוי בתבנית של 24 גם צלחת, אחד יצטרך להכין 12 מ"ל של מדיום זה. מומלץ לכם להכין תוספת קטנה. NGF ניתן לרכוש ממגוון רחב של מקורות מסחריים (ראו טבלה בסוף פרוטוקול זה).
- ציוד: אחד יהיה צורך במיקרוסקופ הניתוח, מקור האור. מתכווננת כפול סיבים אופטיים עם הפנס טיפים התמקדות היא העדיפה. בנוסף, יהיה צורך לנקות לעקר (מעוקר או על ידי השריית באתנול 70% לפחות 20 דקות) כלי החיתוך הבא: שני זוגות של מיקרו לנתח מלקחיים נירוסטה, וזוג מספריים לנתח (גם נירוסטה ושניהם מ Roboz). שני מחטי מזרק סטרילי (26 gague x ½ 1 ס"מ או דומה) יהיה גם צורך. יש צורך להגדיר לוח לנתיחה, המהווה 3 חתיכה "x3" של קלקר עטוף בנייר אלומיניום מכוסה Kimwipe. רסס את הלוח עם אתנול 70% כדי לטהר. לבסוף, להכין אש מלוטש פיפטה מרעה זכוכית. כדי אש פולנית, לקחת את פיפטה זכוכית והחזק את הטיפ הלהבה למשך כמה שניות, בעוד סיבוב. לאחר בדיקה, טיפ תיראה חלקה פתיחת יהיה צר יותר. זה הכרחי עבור השלב שבו התאים יהיה מנותק. בצע אש ליטוש ברדס תרבית תאים כך פיפטה נשאר סטרילי.
2. Dissection של הגרעינים צוואר הרחם מעולה:
- איסוף גורים עכברוש בילוד כי הם בגיל P0 או P1.
- במהירות לנגב את הגור לנתיחה עם אתנול 70% כדי להפחית את הסיכויים לזיהום.
- במהירות לערוף את הגור עם זוג מספריים חדות (שלב זה לא יהיה המוצג בסרטון). החזק את הראש באמצעות מלקחיים סטריליות נגד גזה סטרילית בקצרה לנקז דם עודף.
- מניחים את הראש על כרית דיסקציה עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה, ואת הקצה הזנב מכוונת כלפיך. קנה הנשימה הקטועה צריך להיות גלוי לעין. השתמש במחטים מזרק סטרילי כדי לאבטח את ראשו הכרות לרפד את הניתוחים באופן הבא: לדחוף אחד את הסיכה כי הגג של הפה לתוך כרית ולדחוף את מספר הזיהוי האישי השני כי קנה הנשימה החתוך לתוך כרית. הנח את כרית מתחת למיקרוסקופ לנתח ולהתחיל לנתיחה.
- שימוש בשני מלקחיים (אחד בכל יד) העור לסלק שומן סביב קנה הנשימה, טיפול לא להיכנס עמוק מדי. פעולה זו תחשוף זוג שרירים פועל כמעט במקביל זה לזה משני צדי קנה הנשימה. הערה: במהלך דיסקציה, תצטרך להשקות עם PBS סטרילי קר או קר, סרום חינם בינוני 1640 RPMI נמסר עם סטרילית, פיפטה פסטר לשטוף דם עודף כדי לשמור על האזור נקי ולח. ניתן לעשות זאת רק פעם או יותר מפעם אחת, תלוי כמה מהר מהם עובד. עבור מבתר חוויה, זה לוקח רק כ 2-3 דקות לנתח את זוג הגרעינים.
- השתמש מלקחיים לחתוך ולהסיר את השרירים בצד אחד הראשונים.
- לאחר שריר מוסר, העורק הראשי יהיה גלוי. לעתים קרובות הוא ורדרד בהיר והוא מכיל דם. זה אולי יראה בהיר יותר מאשר כלי דם אחרים אתה עשוי לראות בסביבה ומסיבה זו העורק הראשי לא יכול להיות מורגש מיד. עורק זה פועל לצד קנה הנשימה ואת bifurcates לתוך מה שנראה כמו "Y" בצורת סרט. הסתעפות זו היא ציון דרך חשוב ופעם הוא נמצא, זה יהיה קל יחסית למצוא את SCG.
- סבר העורק בסוף הזנב ביותר להרים אותו מעט עם מלקחיים (את הקצה השני מחובר עדיין). ברגע שאתה עושה את זה, תוכל לראות שקדיות, מבריק מסה קטנה מחפש הרקמה מחוברת באופן רופף העורק רק בנקודת הסתעפות וכי יש thread דמוי מראש ו / או פוסט ganglionic connectives. זהו הגנגליון הצווארי מעולה. השתמש בזוג השני של מלקחיים ביד אחרים לנתק אותו בעדינות ומניחים בצלחת תרבות קטן (35 מ"מ) המכיל קר, סרום חינם RPMI 1640 בינוני.
- לאחר מכן, לחלץ את הגנגליון בצד השני של קנה הנשימה בעקבות פרוטוקול זהה.
3. ניקוי הגרעינים:
- לאחר כל הגרעינים כבר גזור החוצה, הם צריכים להיות משוחרר ככל האפשר של רקמה זרים.
- תחת המיקרוסקופ לנתיחה, אתה עשוי לראות כי בגרעיני יש המצורפת חתיכות של העורק הראשי, רקמת שומן או אחר. עבודה עם מלקחיים בכל יד לקנטר ממנו את החומרים האלה לא רצויות. המקום נוקה הגרעינים לתוך סטרילית 15ml חרוטי, צינור פוליפרופילן, המכיל RPMI 1640 בינוני.
- Connectives מראש ו / או פוסט ganglionic צריך להיות גם מטופח משם. הגנגליון לכל אחד יש כ -10,000 נוירונים. לאחר הנוירונים מצופה, הם יוכלו לצמוח מחדש neurites שלהם.
4. ביסוס תרבות Neuron הסימפתטית:
- צנטריפוגה הגרעינים ב 200xg למשך 2 דקות ו למחוק את supernatant.
- Resuspend הגרעינים ב 0.5-1 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.25%. מקום 37 ˚ C waterbath או בחממה במשך 30 דקות. זה יעזור לנתק את התאים בגרעיני.
- לאחר 30 דקות, להוסיף 10 מ"ל של מדיום השלם לדלל החוצה לנטרל את טריפסין ו צנטריפוגות ב 200xg במשך 2 דקות.
- בטל supernatant ו resuspend ב 2 מ"ל של מדיום הסופי.
- בהמשך לנתק את התאים על ידי triturating הגרעינים למעלה ולמטה עם אש מלוטש פיפטה זכוכית למרעה. Triturate הגרעינים 20 פעמים במקום צינור על קרח למשך כמה דקות.
- בינתיים, אש לצחצח את פיפטה יותר לעשות פתיחת צר (כ 2 / 3 עד 1 / 2 מ"מ קוטר). חכה כמה דקות עד שהוא מתקרר triturate הגרעינים פי 20 יותר. כפי שאתה ממשיך, המדיום יהפוך בהדרגה מעורפל המציין כי התאים נמצאים ניתק. חזור על פעולה זו פעם או פעמיים יותר תלוי גם לנתק את התאים. לאחר זמן מה, תוכלו להבחין כי כל הגרעינים יש ניתק לתוך הנוירונים ולא הגרעינים שלמים נראים בצינור. אולי יש קצת חומר הרקמה לא לנתק. בשלב זה, לתת הצינור לשבת קרח למשך כמה דקות, כך כל פסולת undissociated ניתן ליישב לתחתית. עכשיו בזהירות לאסוף כמעט את כל המדיום מלמעלה ומניחים צינור אחר. על מנת להבטיח כי אתה לא לאסוף את השברים undissociated, להשאיר כ 50 μl בחלק התחתון של הצינור. הוסף יותר של המדיום הסופי צינור המכיל תאים ניתק: בכרך זה תלוי בסוג של צלחת אחת היא באמצעות תרבות לתרבות נוירונים. לדוגמה: אם מנה של 24 גם הוא להיות מועסק, אז 0.5 צלחת הגרעינים היטב לכל (~ 10,000 נוירונים מדי טוב) ב 0.5 מ"ל של מדיום הסופי לכל טוב. המלטה עכברוש טיפוסית מורכבת 12 גורים, אשר ייתן 24 הגרעינים. זה מספיק כדי צלחת אחת 24 גם הזרע ואת הנפח הכולל של המדיום הסופי הוא 12 מ"ל. הערה: הגרעינים מכילים גם אוכלוסייה קטנה של גליה סוגי תאים אחרים יהיו נוכחים בתרבות. Uridine/5-FDU שימוש במדיום הסופי שימנע את שגשוגם ולקדם את מותם.
- הזנת התאים כל 48 שעות על ידי החלפת 2 / 3 של המדיום עם טרי RPMI 1% סוס סרום + NGF ו uridine/5-FDU. הערה: בשלב ראשון, התרבות מכיל נוירונים אוהד שנראים עגול עם neurites לא. Neurites קצר להיות גלוי 24 שעות לאחר דיסקציה בהדרגה להיות צפופים מסועפת יותר לאורך זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו משתמשים חולדות Sprague Dawley עבור התרבויות שלנו.
קח את הזמן והטיפול כאשר מנקים את הגרעינים. הסר את כל פסולת, כלי דם ושומן. שלב זה חשוב בהבטחת תרבות פחות או יותר הומוגני חינם של סוגי תאים זרים. תוספת של uridine/5-FDU יהיה בעיקר לחסל את התאים הלא העצבית (mitotic) הנותרים לזהם את התרבות או לפחות לדכא את התרבות שלהם.
בנוסף, במהלך השלב דיסוציאציה, להיות סבלנית ולקחת את הזמן כדי להפריד בין נוירונים כך שהם לא נמצאים גושים גדולים פעם הם זורעים לצלחות. לאחר גושים גדולים של תאים לא תניב תוצאות הניסוי טוב. לדוגמה, גושים גדולים יקשו את הנוירונים להיות transfected או נגועים. Immunostaining עשויים גם להתעכב וכל הניסויים הדורשים לספור את הנוירונים יהיה קשה לבצע, כמו גם.
אין זה הכרחי כדי להשלים את המדיום עם עט / סטרפטוקוקוס בכל פעם התרבויות ניזונים. תוספת הזמן בעט / סטרפטוקוקוס הראשון התאים הם מצופה מספיק. האם להוסיף uridine/5-FDU טרי עד בינוני בכל פעם המדיום הוא החליף.
השתמשנו תרבות העצבית הסימפתטית ללמוד אפופטוזיס בתגובה לנסיגה-NGF. לדוגמה, ביזוואז et al. 2007 (2), נוירונים אוהד היו transfected עם shRNA נגד מולקולות מספר תפקיד חשוב בקידום אפופטוזיס. Deckwerth et al. 1996 (5) השתמשו נוירונים אוהד מעכברים wildtype עכברים החסרים את הגן הפרו אפופטוטיים, באקס. הם בחנו כיצד הנוירונים האלה מתנהגים כאשר הם משוללי NGF. איור 6 מ ביזוואז et al. 2007 (2) ו איור 3 מ Deckwerth et al. 1996 (5) להראות מה transfected ולא transfected תרבויות העצבית הסימפתטית להיראות, בהתאמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NZ רוצה להודות מעבדה חברי שובהאש ביזוואז, אנדרו Sproul, וראיין Willet לאימונים שלה לנתח והקציר נוירונים אוהד. נתמכות על ידי תרומות של NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
