Summary
यह प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे अलग करने के लिए और संस्कृति नवजात चूहे पिल्ले की बेहतर ग्रीवा ganglia (एससीजी) से प्राथमिक सहानुभूति न्यूरॉन्स है.
Abstract
चूहों में बेहतर ग्रीवा ganglia (एससीजी) छोटे, चमकदार, बादाम के आकार का संरचनाओं कि सहानुभूति न्यूरॉन्स होते हैं. इन न्यूरॉन्स सिर और गर्दन के क्षेत्रों के लिए सहानुभूति innervations प्रदान करते हैं और वे एक अच्छी तरह से विशेषता और अपेक्षाकृत सजातीय जनसंख्या (4) का गठन. सहानुभूति न्यूरॉन्स के अस्तित्व भेदभाव, और axonal विकास और प्रसार व्यापक NGF की उपलब्धता को अपनी संस्कृति और प्रयोगात्मक हेरफेर (2, 3, 6) की सुविधा के लिए तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) पर निर्भर हैं. इन कारणों के लिए, सुसंस्कृत सहानुभूति न्यूरॉन्स अध्ययन की एक विस्तृत विविधता में neuronal विकास और भेदभाव, और क्रमादेशित रोग कोशिका मृत्यु के तंत्र, और संकेत पारगमन (1, 2, 5, और 6) सहित इस्तेमाल किया गया है. नवजात चूहों और संवर्धन सहानुभूति न्यूरॉन्स से बाहर विदारक एससीजी बहुत जटिल नहीं है और काफी जल्दी में महारत हासिल किया जा सकता है है. इस अनुच्छेद में, हम विस्तार से वर्णन कैसे बाहर काटना नवजात चूहे पिल्ले से एससीजी और उन्हें उपयोग करने के लिए सहानुभूति न्यूरॉन्स की संस्कृतियों की स्थापना करेंगे. लेख भी तैयारी कदम और विभिन्न अभिकर्मकों और उपकरण है कि इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए की जरूरत है वर्णन करेंगे.
Protocol
1. विच्छेदन के लिए तैयार:
- उपयुक्त संस्कृति पकवान (10 सेमी या छह अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह प्लेटें, आदि) अपने प्रयोगों की प्रकृति पर निर्भर करता है, और उन्हें चूहे की पूंछ कोलेजन विच्छेदन से पहले 24 घंटे के साथ कोट का चयन करें. चूहा - पूंछ कोलेजन की तैयारी और यह कोट संस्कृति बर्तन का उपयोग करने के लिए तरीके कहीं वर्णित किया गया है (1).
- फॉस्फेट में 0.25% trypsin समाधान तैयार (पीबीएस) खारा (नहीं EDTA) और फिल्टर बाँझ buffered. -20 º सी. पर 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान की तैयारी
- आसुत विआयनीकृत / 2 एच ओ में 2.5 मिमी uridine के प्रत्येक और 5-FDU युक्त समाधान तैयार फ़िल्टर बाँझ और 50 μl aliquots तैयार. -20 º सी. पर स्टोर
- 10% गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम (गर्मी के 30 मिनट के लिए एक 56 º सी waterbath में incubating द्वारा निष्क्रिय) और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ RPMI 1640 संस्कृति मध्यम: मध्यम पूरा तैयार है.
- अंतिम मध्यम तैयार:% 1 निष्क्रिय घोड़े सीरम + NGF (100ηg/ml अंतिम एकाग्रता) + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU समाधान गर्मी के साथ RPMI 1640 संस्कृति मध्यम (10 सुक्ष्ममापी अंतिम एकाग्रता) . नोट: इस माध्यम को ताजा किया जाना चाहिए से पहले हर समय का उपयोग. 24 अच्छी तरह से एक थाली प्रारूप में एक प्रयोग के लिए, एक करने के लिए इस माध्यम के 12 मिलीलीटर तैयार की आवश्यकता होगी. यह अनुशंसा की जाती है कि आप एक छोटे से अतिरिक्त तैयार है. NGF वाणिज्यिक सूत्रों की एक किस्म इस प्रोटोकॉल के अंत में (टेबल देखें) से खरीदा जा सकता है है.
- उपकरण: एक खुर्दबीन विदारक और प्रकाश स्रोत की आवश्यकता होगी. ध्यान केंद्रित सुझावों के साथ एक दोहरी gooseneck फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक पसंद है. सूक्ष्म स्टेनलेस स्टील संदंश विदारक के दो जोड़े और विदारक कैंची की एक जोड़ी (स्टेनलेस स्टील भी: इसके अलावा, एक स्वच्छ और बाँझ (autoclaving या कम से कम 20 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में भिगोने के द्वारा) निम्नलिखित विच्छेदन उपकरण की आवश्यकता होगी और Roboz से दोनों). दो बाँझ सिरिंज सुई (26 gague x 1 आधा इंच या इसी तरह) भी जरूरत होगी. यह आवश्यक है करने के लिए एक विच्छेदन बोर्ड, जो स्टायरोफोम के 3 "x3" टुकड़ा एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे और एक Kimwipe साथ कवर सेट. 70% करने के लिए शुद्ध करना इथेनॉल के साथ बोर्ड स्प्रे. अंत में, एक आग पॉलिश कांच चरागाह विंदुक तैयार करते हैं. आग पॉलिश करने के क्रम में, कांच विंदुक ले और कुछ सेकंड के लिए लौ में टिप पकड़ है, जबकि घूर्णन. निरीक्षण पर, टिप चिकनी देखो और खोलने संकरा हो जाएगा. यह कदम जहां कोशिकाओं को अलग किया जाएगा के लिए आवश्यक है. एक सेल संस्कृति हुड में आग चमकाने प्रदर्शन इतना है कि विंदुक बाँझ रहता है.
2. सुपीरियर सरवाइकल ganglia के विच्छेदन:
- नवजात चूहे पिल्ले लीजिए कि उम्र P0 या P1 के हैं.
- विच्छेदन के लिए तेजी से 70% इथेनॉल के साथ पिल्ला संदूषण की संभावना कम पोंछ.
- कैंची की एक तेज जोड़ी (इस वीडियो में कदम नहीं दिखाया जाएगा) के साथ तेजी से पिल्ला सिर काटना. बाँझ धुंध के खिलाफ बाँझ संदंश का उपयोग करने के लिए संक्षेप में अतिरिक्त रक्त नाली सिर पकड़ो.
- उदर पक्ष का सामना करना पड़ रहा है और आप की ओर उन्मुख दुम अंत के साथ विच्छेदन पैड पर सिर रखें. कटे ट्रेकिआ आसानी से दिखाई जानी चाहिए. बाँझ सिरिंज सुई का प्रयोग करने के लिए निम्नलिखित तरीके में विदारक पैड के कटे हुए सिर को सुरक्षित: एक पिन पैड में मुँह की छत हालांकि धक्का और पैड में ट्रेकिआ कटे हालांकि दूसरे पिन धक्का. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पैड प्लेस और विच्छेदन शुरू.
- दोनों (प्रत्येक हाथ में एक) दूर स्पष्ट और ट्रेकिआ के आसपास त्वचा वसा संदंश का प्रयोग, देखभाल लेने के लिए नहीं जाना भी गहरी. यह कर चल मांसपेशियों ट्रेकिआ के दोनों तरफ लगभग एक दूसरे के समानांतर एक जोड़ी का खुलासा होगा. नोट: विच्छेदन के दौरान, आप ठंड बाँझ पीबीएस या ठंडे, सीरम मुक्त RPMI 1640 एक बाँझ, पाश्चर विंदुक के साथ दिया दूर अतिरिक्त रक्त धोने और क्षेत्र को साफ और नम रखने के माध्यम से सिंचाई की आवश्यकता होगी. कितनी तेजी से काम करता है इस पर निर्भर करता है केवल एक बार या एक से अधिक बार की जा सकती है. एक अनुभव चीड़फाड़ करनेवाला के लिए, यह के बारे में केवल दो से तीन मिनट लगते हैं के लिए बाहर ganglia की एक जोड़ी काटना.
- में कटौती और एक तरफ मांसपेशियों को दूर पहली बार संदंश का प्रयोग करें.
- एक बार की मांसपेशी निकाल दिया जाता है, मन्या धमनी दिखाई हो जाएगा. अक्सर यह प्रकाश गुलाबी है और रक्त शामिल हैं. यह अन्य रक्त वाहिकाओं से रंग में लाइटर है कि आप आसपास के क्षेत्र में देख सकते हैं दिखाई देते हैं और इस कारण के लिए मन्या धमनी नजर अभी नहीं हो सकता है हो सकता है. इस धमनी क्या एक के आकार का "वाई" रिबन की तरह लग रहा है में ट्रेकिआ और bifurcates के साथ चलाता है. इस विभाजन में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर है और एक बार यह स्थित है, यह अपेक्षाकृत आसान होना करने के लिए एससीजी मिल जाएगा.
- सबसे दुम अंत में धमनी तोड़ और यह संदंश (दूसरे छोर अभी भी जुड़ी है) के साथ थोड़ा उठा. एक बार जब आप इस करते हैं, आप एक बादाम के आकार, चमकदार देख ऊतक के छोटे बड़े पैमाने पर है कि विभाजन के बिंदु पर बस शिथिल धमनी को संलग्न और कहा कि देख thr हैपूर्व और / या पोस्ट ganglionic connectives ead की तरह. यह बेहतर गर्भाशय ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि है. दूसरे हाथ में संदंश के एक दूसरे जोड़ी का उपयोग करने के लिए धीरे एक छोटे संस्कृति पकवान ठंड, सीरम मुक्त RPMI 1640 मध्यम युक्त (35 मिमी) में है और यह जगह अलग.
- अगला, ट्रेकिआ के दूसरे पक्ष पर एक ही प्रोटोकॉल निम्नलिखित नाड़ीग्रन्थि निकालने.
3. Ganglia सफाई:
- एक बार सभी ganglia dissected किया गया है, वे के रूप में के रूप में बाहरी ऊतक के संभव में मुक्त किया जाना चाहिए.
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, आप देख सकते हैं कि ganglia मन्या धमनी, वसा या अन्य ऊतकों के टुकड़े संलग्न है. प्रत्येक हाथ में संदंश के साथ कार्य करने के लिए दूर इन अवांछित सामग्री तंग. प्लेस एक बाँझ 15ml शंक्वाकार, polypropylene ट्यूब में साफ ganglia, RPMI 1640 मध्यम युक्त.
- पूर्व और / या पोस्ट ganglionic connectives भी छंटनी दूर किया जाना चाहिए. प्रत्येक नाड़ीग्रन्थि के बारे में 10,000 न्यूरॉन्स है. एक बार जब न्यूरॉन्स चढ़ाया जाता है, वे अपने neurites regrow जाएगा.
4. सहानुभूति न्यूरॉन संस्कृति की स्थापना:
- 200xg पर 2 मिनट के लिए ganglia और अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 0.25% trypsin समाधान के 0.5 से 1 मिलीलीटर में ganglia Resuspend. 30 मिनट के लिए एक 37 ˚ सी waterbath या इनक्यूबेटर में रखें. यह ganglia में कोशिकाओं को अलग कर देना करने में मदद करेगा.
- 30 मिनट के बाद, पूरा करने के लिए बाहर पतला और trypsin और 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 200xg बेअसर मध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
- सतह पर तैरनेवाला और अंतिम मध्यम के 2 मिलीलीटर में resuspend त्यागें.
- इसके अलावा ganglia आग पॉलिश कांच चरागाह विंदुक के साथ ऊपर और नीचे triturating द्वारा कोशिकाओं को अलग कर देना. Ganglia 20 बार Triturate और कुछ मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब की जगह.
- इस बीच, आग पॉलिश अधिक विंदुक खोलने संकरा बनाने (लगभग व्यास में मिमी / 2 से 3 1 / 2). कुछ मिनट रुको जब तक यह ठंडा है और ganglia 20 गुना अधिक triturate. जैसा कि आप जारी रखते हैं, मध्यम उत्तरोत्तर cloudier संकेत है कि कोशिकाओं को अलग किया जा रहा है हो जाएगा. यह एक या अधिक दो बार अच्छी तरह से कैसे कोशिकाओं को अलग कर देना के आधार पर कदम दोहराएँ. कुछ समय के बाद, तुम नोटिस करेंगे कि सभी ganglia न्यूरॉन्स में अलग है और कोई बरकरार ganglia ट्यूब में दिखाई दे रहे हैं. कुछ ऊतक सामग्री है कि अलग कर देना नहीं होगा हो सकता है. इस बिंदु पर, ट्यूब एक कुछ मिनट के लिए बर्फ में बैठना इतना है कि किसी भी undissociated मलबे के नीचे से व्यवस्थित कर सकते हैं. अब ध्यान से और एक और ट्यूब में शीर्ष स्थान से मध्यम के लगभग सभी एकत्र. सुनिश्चित करें कि आप undissociated मलबे जमा नहीं करने के लिए, ट्यूब के नीचे के बारे में 50 μl छोड़. Dissociated ट्यूब युक्त कोशिकाओं को अंतिम माध्यम जोड़ें: इस खंड संस्कृति की थाली एक संस्कृति न्यूरॉन्स उपयोग कर रहा है के प्रकार पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए: अगर 24 अच्छी तरह से एक डिश के लिए नियोजित किया जा रहा है, तो अच्छी तरह से प्रति प्लेट 0.5 अच्छी तरह से प्रति अंतिम माध्यम के 0.5 मिलीलीटर में ganglia (~ अच्छी तरह से प्रति +१०,००० न्यूरॉन्स). एक ठेठ चूहे कूड़े 12 पिल्ले, जो 24 ganglia देना होगा होते हैं. यह बीज एक थाली 24 अच्छी तरह से और अंतिम माध्यम की कुल मात्रा 12 मिलीलीटर करने के लिए पर्याप्त है. नोट: ganglia भी glia और अन्य प्रकार की कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी है कि संस्कृति में मौजूद हो जाएगा शामिल है. अंतिम माध्यम Uridine/5-FDU का उपयोग करना उनके प्रसार को रोकने और उनकी मौत को बढ़ावा देंगे.
- फ़ीड कोशिकाओं ताजा RPMI 1% घोड़े सीरम + NGF और uridine/5-FDU के साथ / 2 माध्यम की 3 जगह द्वारा हर 48 घंटे. नोट: सबसे पहले, संस्कृति सहानुभूति न्यूरॉन्स कि कोई neurites के साथ दौर देखो. लघु neurites विच्छेदन के बाद दिखाई 24 घंटे हो जाते हैं और उत्तरोत्तर denser और अधिक समय पर branched हो.
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Discussion
हम हमारे संस्कृतियों के लिए Sprague Dawley चूहों का उपयोग करें.
समय और ध्यान रखना जब ganglia सफाई. सभी मलबे, रक्त वाहिकाओं और वसा निकालें. यह कदम एक संस्कृति है कि अधिक या कम सजातीय और बाहरी सेल प्रकार के मुक्त है सुनिश्चित करने में महत्वपूर्ण है. uridine/5-FDU के अलावा काफी हद तक किसी भी शेष गैर neuronal (mitotic) संस्कृति contaminating कोशिकाओं को खत्म करने या कम से कम उनके प्रसार को दबाने.
इसके अलावा, हदबंदी चरण के दौरान, रोगी हो और समय लेने के न्यूरॉन्स को अलग इतना है कि वे बड़े clumps में नहीं मिला है एक बार वे प्लेटों पर वरीयता प्राप्त हैं. कोशिकाओं के बड़े clumps होने अच्छा प्रयोगात्मक परिणाम नहीं निकलेगा. उदाहरण के लिए, बड़े clumps यह मुश्किल न्यूरॉन्स ट्रांसफ़ेक्ट हो या संक्रमित के लिए कर देगा. Immunostaining और भी रुकावट हो सकता है किसी भी प्रयोगों है कि न्यूरॉन्स की गिनती की आवश्यकता करने के लिए बाहर ले, के रूप में अच्छी तरह से मुश्किल हो जाएगा.
यह कलम strep / हर बार संस्कृतियों तंग आ चुके हैं के साथ मध्यम पूरक करने के लिए आवश्यक नहीं है. / कलम strep बहुत पहली बार कोशिकाओं चढ़ाया जाता है के अलावा पर्याप्त है. मध्यम के लिए ताजा uridine/5-FDU हर समय मध्यम विमर्श जोड़ने मत करो.
हम सहानुभूति neuronal संस्कृति का इस्तेमाल किया है NGF - वापसी के जवाब में apoptosis का अध्ययन. उदाहरण के लिए, बिस्वास एट अल में. 2007 (2), सहानुभूति न्यूरॉन्स shRNA के साथ कई अणुओं है कि apoptosis को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के खिलाफ ट्रांसफ़ेक्ट थे. Deckwerth एट अल. 1996 (5) wildtype चूहों और चूहों के जीन समर्थक apoptotic Bax की कमी से सहानुभूति न्यूरॉन्स का इस्तेमाल किया है. वे कैसे इन न्यूरॉन्स व्यवहार जब वे NGF से वंचित कर रहे हैं पर ध्यान दिया है. बिस्वास एट अल से 6 चित्रा. 2007 (2) और Deckwerth एट अल से चित्रा 3. 1996 (5) क्या शो ट्रांसफ़ेक्ट और गैर ट्रांसफ़ेक्ट सहानुभूति neuronal संस्कृतियों की तरह, क्रमशः देखो.
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Acknowledgments
NZ उसे सहानुभूति न्यूरॉन्स विदारक और कटाई में प्रशिक्षण के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों सुभाष बिस्वास, एंड्रयू Sproul, और रयान Willet धन्यवाद देना चाहूंगा. NIH-NINDS से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
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