Summary
Dit is een protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur primaire sympathische neuronen van een superieure cervicale ganglia (SCG) van pasgeboren ratten pups.
Abstract
De superieure cervicale ganglia (SCG) bij ratten zijn kleine, glanzende, amandel-vormige structuren die sympathische neuronen bevatten. Deze neuronen zorgen sympathiek innervaties voor het hoofd en de nek regio en vormen zij een goed gekarakteriseerd en relatief homogene populatie (4). Sympathische neuronen zijn afhankelijk van zenuw groeifactor (NGF) om te overleven, differentiatie en axonale groei en de wijdverbreide beschikbaarheid van de NGF vergemakkelijkt hun cultuur en experimentele manipulatie (2, 3, 6). Om deze redenen hebben gekweekte sympathische neuronen is gebruikt in een breed scala van studies met inbegrip van neuronale ontwikkeling en differentiatie, mechanismen van geprogrammeerde celdood en pathologische, en signaaltransductie (1, 2, 5 en 6). Ontleden van de SCG van pasgeboren ratten en het kweken van sympathische neuronen is niet erg ingewikkeld en kan vrij snel onder de knie. In dit artikel zullen we in detail beschrijven hoe te ontleden het SCG van pasgeboren ratten pups en om ze te gebruiken om culturen van sympathische neuronen vast te stellen. Het artikel zal beschrijven ook de voorbereidende stappen en de verschillende reagentia en apparatuur die nodig zijn om dit te bereiken.
Protocol
1. Voorbereiding voor de dissectie:
- Selecteer de juiste cultuur schotel (10 cm of 6-well of 24-well platen, enz.), afhankelijk van de aard van uw experimenten, en smeer ze met een rat-tail collageen 24 uur voor dissectie. De methoden voor het bereiden van rat-tail collageen en dat te gebruiken vacht cultuur gerechten zijn elders beschreven (1).
- Bereid een 0,25% trypsine oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (geen EDTA) en filter steriliseren. Voor te bereiden 1 ml porties en bewaar bij -20 º C.
- Bereid een oplossing die 2,5 mM elk van Uridine en 5-FDU in gedistilleerd / gedemineraliseerd H 2 O. Filter-steriliseren en bereiden 50 ui fracties. Bewaren bij -20 º C.
- Bereid Compleet Medium: RPMI 1640 kweekmedium met 10% hitte-geïnactiveerd paard serum (warmte inactiveren door incuberen in een 56 º C waterbad gedurende 30 minuten) en 5% foetaal runderserum.
- Bereid Final Medium: RPMI 1640 kweekmedium met 1% hitte-geïnactiveerd serum paard + NGF (100ηg/ml uiteindelijke concentratie) + penicilline / streptomycine (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU oplossing (10 uM eindconcentratie) . Let op: dit medium moet worden samengesteld uit verse voor gebruik elke keer. Voor een experiment in een 24-well plaat formaat, zal men moeten 12 ml van dit medium te bereiden. Het wordt aanbevolen dat u een beetje extra voor te bereiden. NGF kunnen worden gekocht bij een verscheidenheid van commerciële bronnen (zie tabel aan het einde van dit protocol).
- Uitrusting: Men zal een dissectiemicroscoop en lichtbron nodig hebben. Een dubbele zwanenhals glasvezel verlichting met scherpstellen tips heeft de voorkeur. Daarnaast zal een behoefte te reinigen en steriliseren (in de autoclaaf of onderdompelen in 70% ethanol gedurende tenminste 20 minuten) de volgende dissectie-instrumenten: twee paren van micro-ontleden RVS tang, en een paar van de ontleding schaar (ook roestvrij staal en zowel van Roboz). Twee steriele injectienaalden (26 gague x 1 ½ cm of iets dergelijks) zal ook nodig zijn. Het is noodzakelijk om een dissectie bord, dat is een 3 "x3" stuk van piepschuim verpakt in aluminium folie en afgedekt met een Kimwipe. Spray het bord met 70% ethanol te saneren. Tot slot, bereiden een brand-gepolijst glas weiland pipet. Met het oog op brand-polijsten, neem de glazen pipet en houd de tip in de vlam een paar seconden, tijdens het draaien. Bij de inspectie, zal de tip gladder en de opening zal worden smaller. Dit is nodig voor de stap, waar de cellen los worden gezien. Uitvoeren van brand-polijsten in een celkweek kap, zodat de pipet blijft steriel.
2. Dissectie van Superior Cervicale Ganglia:
- Verzamel neonatale rat pups die de leeftijd van P0 of P1.
- Oogwenk de pup voor de dissectie met 70% ethanol om de kansen op besmetting te verminderen.
- Snel onthoofden pup met een scherpe schaar (deze stap zal niet worden getoond in de video). Houd het hoofd met behulp van steriele pincet tegen steriel gaasje in het kort uitlekken overtollig bloed.
- Plaats het hoofd op de dissectie pad met de buikzijde naar boven en de caudale einde gericht naar u toe. Het afgehakte luchtpijp moet gemakkelijk zichtbaar zijn. Gebruik de steriele injectienaalden op het afgehakte hoofd vast te zetten het ontleden pad op de volgende manier: een pin duw hoewel het dak van de mond in de pad en de tweede pin hoewel de luchtpijp doorgesneden in het pad te duwen. Plaats de elektrode onder de microscoop ontleden en beginnen dissectie.
- Met behulp van zowel tang (een in elke hand) opruimen huid en vet rond de luchtpijp, zorg niet te gaan te diep. Door dit te doen zal blootstellen een paar van de spieren loopt bijna parallel aan elkaar aan weerszijden van de luchtpijp. Let op: tijdens de dissectie, moet u spoelen met een koude steriele PBS of koud, serumvrij RPMI 1640 medium geleverd met een steriele, Pasteur pipet weg te spoelen overtollig bloed en te houden het gebied schoon en vochtig. Dit kan slechts een keer of meer dan een keer worden gedaan, afhankelijk van hoe snel men werkt. Voor een ervaring dissector, het duurt maar ongeveer twee tot drie minuten te ontleden uit een paar ganglia.
- Gebruik de tang te snijden en de spier verwijder dan eerst aan een kant.
- Zodra de spier is verwijderd, wordt de halsslagader zichtbaar worden. Vaak is het licht roze en bevat bloed. Het kan erop lijken lichter van kleur dan de andere bloedvaten die u kunt zien in de omgeving en om deze reden de halsslagader misschien niet meteen merkbaar. Deze slagader loopt langs de luchtpijp en splitst in wat eruit ziet als een "Y"-vormige lint. Deze bifurcatie is een belangrijke mijlpaal en als het eenmaal is gevestigd, zal het relatief eenvoudig om de SCG te vinden.
- Scheiden van de slagader op de meest caudale einde en til deze iets omhoog met de tang (de andere kant is nog steeds verbonden). Zodra u dit doet, ziet u een amandelvormig, glanzend zoek kleine massa van weefsel dat losjes is om de slagader aangesloten net op het punt van bifurcatie en dat heeft THREAD-achtige pre-en / of postganglionnaire connectieven. Dit is de superieure cervicale ganglion. Gebruik een tweede paar pincetten in de andere hand om het voorzichtig los en plaats in een kleine cultuur schaal (35 mm) met koud, serum vrij RPMI 1640-medium.
- Vervolgens pak het ganglion aan de andere kant van de luchtpijp volgens hetzelfde protocol.
3. Het reinigen van de Ganglia:
- Zodra alle ganglia zijn ontleed uit, moeten ze worden vrijgelaten zoveel mogelijk van vreemde weefsel.
- Onder de dissectie microscoop, ziet u dat de ganglia hebben stukken van de halsslagader, vet of ander weefsel bevestigd. Werken met een pincet in elke hand te plagen weg deze ongewenste stoffen. Plaats schoongemaakt ganglia in een steriele 15ml conische, polypropyleen buis, met RPMI 1640-medium.
- De pre-en / of postganglionnaire connectieven moet ook weg worden getrimd. Elke ganglion heeft ongeveer 10.000 neuronen. Zodra de neuronen zijn verguld, zullen ze teruggroeien hun neurieten.
4. Tot vaststelling van Sympathische Neuron cultuur:
- Centrifugeer de ganglia op 200xg gedurende 2 minuten en gooi het supernatant.
- Resuspendeer de ganglia in 0,5 tot 1 ml van 0,25% trypsine oplossing. Leg ze in een 37 ˚ C waterbad of broedstoof gedurende 30 minuten. Dit zal helpen scheiden van de cellen in de ganglia.
- Na 30 minuten, voeg 10 ml compleet medium om te verdunnen uit en neutraliseren van de trypsine en centrifugeer bij 200xg gedurende 2 minuten.
- Gooi supernatant en resuspendeer in 2 ml van Final Medium.
- Verder distantiëren van de cellen door fijnwrijven de ganglia op en neer met de brand-gepolijst glas weiland pipet. Vermaal het ganglia 20 keer en plaats de buis op ijs voor een paar minuten.
- Ondertussen, brand-polish de pipet meer om de opening smaller (ongeveer 2 / 3 tot 1 / 2 mm in diameter). Wacht een paar minuten tot het afkoelt en vermaal het ganglia 20 keer meer. Zoals je doorgaat, wordt het medium worden steeds troebeler aangeeft dat de cellen worden gescheiden worden. Herhaal deze stap een of twee keer meer, afhankelijk van hoe goed de cellen scheiden. Na enige tijd zult u merken dat alle ganglia hebben gedissocieerd in de neuronen en geen intact ganglia zijn zichtbaar in de buis. Er kan wat weefsel materiaal dat niet distantiëren worden. Op dit punt, laat de buis in ijs zitten voor een paar minuten, zodat elke ongedissocieerde vuil kan naar de bodem. Nu zorgvuldig verzamelen bijna alle van het medium uit de top en in een andere buis. Om ervoor te zorgen dat u niet de ongedissocieerde vuil te verzamelen, laat ongeveer 50 ui op de bodem van de buis. Voeg meer van de Final medium om de buis met gescheiden cellen: dit volume afhankelijk van het type van de cultuur plaatje een is gebruikt om de cultuur van de neuronen. Bijvoorbeeld: als een 24-well gerecht dient te worden toegepast, dan plaat 0,5 ganglia per well (~ 10.000 neuronen per well) in 0,5 ml van Final medium per putje. Een typische rat nest bestaat uit 12 pups, waarvan 24 ganglia zou geven. Dit is genoeg om zaad een 24-wells plaat en het totale volume van Final medium is 12 ml. Opmerking: de ganglia bevatten ook een kleine populatie van de glia en andere celtypen die aanwezig zal zijn in de cultuur. Met behulp van Uridine/5-FDU in het uiteindelijke medium wordt voorkomen dat hun verspreiding en het bevorderen van hun dood.
- Feed cellen elke 48 uur door het vervangen van 2 / 3 van het medium met verse RPMI +1% paard serum + NGF en uridine/5-FDU. Opmerking: In het begin, de cultuur bevat sympathische neuronen die er rond met geen neurieten. Korte neurieten zichtbaar worden 24 uur na de dissectie en geleidelijk dichter en meer vertakt in de tijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We maken gebruik van Sprague Dawley ratten voor onze culturen.
Neem de tijd en zorg bij het schoonmaken van de ganglia. Verwijder alle vuil, bloedvaten en vet. Deze stap is belangrijk te zorgen voor een cultuur die is min of meer homogeen en vrij van vreemde celtypen. De toevoeging van uridine/5-FDU zal grotendeels te elimineren alle resterende niet-neuronale (mitotische) cellen besmetten van de cultuur of in ieder geval onderdrukken hun proliferatie.
Daarnaast, tijdens de dissociatie stap, wees geduldig en neem de tijd om de neuronen scheiden, zodat ze niet worden gevonden in grote klonters als ze eenmaal zijn gezaaid op de platen. Met grote massa's van cellen zullen niet toegeven goede experimentele resultaten. Zo zal grote klonten het moeilijk maken voor de neuronen te worden getransfecteerd of geïnfecteerd. Immunokleuring kan ook worden belemmerd en alle experimenten die vereisen dat het tellen van de neuronen zal moeilijk zijn uit te voeren, als goed.
Het is niet nodig om het medium te vullen met pen / strep elke keer dat de culturen worden gevoed. Toevoeging van pen / strep de allereerste keer dat de cellen worden uitgeplaat is voldoende. Do Toevoegen verse uridine/5-FDU aan het medium telkens als het medium wordt uitgewisseld.
We hebben gebruik gemaakt sympathiek neuronale cultuur tot apoptose bestuderen in reactie op de NGF-terugtrekking. Bijvoorbeeld, in Biswas et al.. 2007 (2), werden sympathiek neuronen getransfecteerd met shRNA tegen verschillende moleculen die een belangrijke rol spelen bij het bevorderen van apoptose. Deckwerth et al.. 1996 (5) gebruik hebben gemaakt van sympathische neuronen van wildtype muizen en muizen die de pro-apoptotische gen, Bax. Ze hebben gekeken naar hoe deze neuronen zich gedragen wanneer ze worden beroofd van NGF. Figuur 6 van Biswas et al.. 2007 (2) en figuur 3 uit Deckwerth et al.. 1996 (5) laten zien wat getransfecteerde en niet-getransfecteerde sympathieke neuronale culturen lijken, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NZ wil lab leden Subhas Biswas, Andrew Sproul, en Ryan Willet bedanken voor de opleiding van haar in te ontleden en te oogsten sympathische neuronen. Ondersteund door subsidies van de NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
