Summary
C'est un protocole décrivant la façon d'isoler et de culture primaire de neurones sympathiques des ganglions cervicaux supérieurs (GCS) de ratons nouveau-né.
Abstract
Les ganglions cervicaux supérieurs (GCS) chez les rats sont petites, brillant, en forme d'amande structures qui contiennent des neurones sympathiques. Ces neurones fournissent innervations sympathiques pour la tête et du cou et ils constituent une population bien caractérisés et relativement homogène (4). Neurones sympathiques sont tributaires du facteur de croissance nerveuse (NGF) pour la croissance de survie, la différenciation et axonale et la généralisation de la disponibilité du NGF facilite leur culture et leur manipulation expérimentale (2, 3, 6). Pour ces raisons, des cultures de neurones sympathiques ont été utilisés dans un large éventail d'études, y compris le développement neuronal et la différenciation, les mécanismes de mort cellulaire programmée et pathologiques, et la transduction du signal (1, 2, 5 et 6). Disséquer la CTB à partir de rats nouveau-nés et les neurones sympathiques en culture n'est pas très compliqué et peut être maîtrisé assez rapidement. Dans cet article, nous allons décrire en détail comment disséquer la CTB de ratons nouveau-nés et à les utiliser pour établir des cultures de neurones sympathiques. L'article décrit également les étapes préparatoires et les différents réactifs et du matériel qui sont nécessaires pour atteindre cet objectif.
Protocol
1. Préparation à la dissection:
- Sélectionnez la boîte de culture approprié (10 cm ou des plaques 6 puits ou 24 puits, etc) selon la nature de vos expériences, et les enduire de collagène de queue de rat 24 heures avant la dissection. Les méthodes de préparation de collagène de queue de rat et l'utiliser pour des boîtes de culture manteau ont été décrites ailleurs (1).
- Préparer une solution de trypsine à 0,25% en tampon phosphate salin (PBS) (sans EDTA) et stériliser par filtration. Préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C.
- Préparer une solution contenant 2,5 mM de chacun des uridine et de 5-FDU dans l'eau distillée / désionisée H 2 O. Filtre-stériliser et préparer 50 aliquotes. Entreposer à -20 º C.
- Préparer le milieu complet: milieu de culture RPMI 1640 avec inactivés par la chaleur de 10% de sérum de cheval (chaleur inactiver en incubant dans un bain-marie 56 º C pendant 30 minutes) et 5% de sérum fœtal bovin.
- Préparer milieu final: milieu de culture RPMI 1640 avec inactivés par la chaleur de 1% de sérum de cheval + NGF (100ηg/ml concentration finale) + pénicilline / streptomycine (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU solution (concentration de 10 uM final) . Remarque: ce moyen doit être constitué fraîches avant de les utiliser à chaque fois. Pour une expérience dans un format de plaque de 24 puits, on aura besoin pour préparer 12 ml de ce milieu. Il est recommandé de préparer un petit supplément. NGF peuvent être achetés auprès de diverses sources commerciales (voir le tableau à la fin de ce protocole).
- Equipement: Un besoin d'une loupe binoculaire et la source lumineuse. Un illuminateur col de cygne double fibre optique avec des conseils au point est préféré. En outre, on aura besoin pour nettoyer et stériliser (par autoclavage ou par trempage dans de l'éthanol 70% pendant au moins 20 minutes) les outils de dissection suivante: deux paires de pinces à disséquer les micro-acier inoxydable, et une paire de ciseaux de dissection (également en acier inoxydable et de deux de Roboz). Deux aiguilles de seringues stériles (26 x gague 1 ½ pouces ou similaire) seront également nécessaires. Il est nécessaire de mettre en place un conseil de dissection, qui est un 3 "x3" morceau de styromousse enveloppé dans du papier aluminium et recouvert d'une Kimwipe. Vaporiser le conseil d'éthanol à 70% pour décontaminer. Enfin, préparer un feu poli pipette en verre pâturages. Afin de feu polonais, prendre la pipette en verre et maintenez la pointe de la flamme pendant quelques secondes, tout en tournant. Lors de l'inspection, la pointe sera un aspect plus lisse et l'ouverture sera plus étroite. Cela est nécessaire pour l'étape où les cellules seront dissociées. Effectuer poli-feu dans une hotte de culture cellulaire de telle sorte que la pipette reste stérile.
2. La dissection de ganglions cervicaux Supérieur:
- Recueillir les ratons nouveau-nés qui sont en âge de P0 ou P1.
- Rapidement essuyez le chiot pour la dissection à l'éthanol 70% pour réduire les risques de contamination.
- Rapidement décapiter chiot avec une paire de ciseaux (cette étape ne sera pas montré dans la vidéo). Tenir la tête à l'aide des pinces stériles de gaze stérile contre les égoutter brièvement excès de sang.
- Placez la tête sur le pavé de dissection avec la face ventrale vers le haut et l'extrémité caudale orientée vers vous. La trachée coupée doit être facilement visible. Utiliser les aiguilles de seringues stériles pour sécuriser la tête coupée au pad dissection de la manière suivante: pousser une broche si le toit de la bouche dans le pad et poussez la seconde broche si la trachée coupée dans le coussinet. Placez le coussin sous le microscope de dissection et de commencer la dissection.
- En utilisant les deux pinces (une dans chaque main) la peau claire loin et de graisse autour de la trachée, en prenant soin de ne pas aller trop profond. Faire cela va exposer une paire de muscles courant presque parallèlement les uns aux autres de chaque côté de la trachée. Remarque: lors de la dissection, vous aurez besoin d'irriguer avec du PBS stérile à froid ou à froid, sans sérum du milieu RPMI 1640 livré avec une pipette stérile, Pasteur pour laver l'excès de sang et de garder l'endroit propre et humide. Cela peut être fait qu'une seule fois ou plusieurs fois selon la vitesse on travaille. Pour un dissecteur expérience, il ne prend que deux à trois minutes de disséquer une paire de ganglions.
- Utilisez la pince pour couper et enlever le muscle d'un côté d'abord.
- Une fois que le muscle est enlevé, l'artère carotide deviendra visible. Souvent, il est léger rosé et contient du sang. Il peut apparaître plus clair que d'autres vaisseaux sanguins que vous pouvez voir dans les environs et pour cette raison l'artère carotide ne peut pas être perceptible immédiatement. Cette artère longe la trachée et se divise en ce qui ressemble à un "Y" en forme de ruban. Cette bifurcation est un jalon important et une fois il se trouve, il sera relativement facile de trouver la CTB.
- Sever de l'artère à l'extrémité la plus caudale et soulevez-le légèrement avec la pince (l'autre extrémité est encore attaché). Une fois que vous faites cela, vous verrez une forme d'amande, brillant de masse à la recherche de tissu qui est lâchement à l'artère juste au point de bifurcation et qui a thread-comme pré-et / ou post-ganglionnaires connectifs. C'est le ganglion cervical supérieur. Utilisez une deuxième paire de pince dans l'autre main au détachez qu'elle et sa place dans une boîte de culture de petite taille (35 mm) contenant le froid, sans sérum du milieu RPMI 1640.
- Ensuite, extraire le ganglion de l'autre côté de la trachée suivant le même protocole.
3. Nettoyage les ganglions:
- Une fois que tous les ganglions ont été disséquées, ils devraient être libérés, autant que possible des tissus étrangers.
- Sous le microscope de dissection, vous pouvez voir que les ganglions ont attaché des morceaux de l'artère carotide, le tissu adipeux ou autres. Travailler avec une pince dans chaque main pour taquiner l'écart de ces matières indésirables. Placez nettoyé ganglions dans une stérile conique 15ml, tube en polypropylène, contenant du milieu RPMI 1640.
- Les connecteurs pré-et / ou post-ganglionnaires doivent également être coupé. Chaque ganglion a environ 10.000 neurones. Une fois que les neurones sont plaqués, ils vont repousser leurs neurites.
4. Établir la culture des neurones sympathiques:
- Centrifuger les ganglions au 200xg pendant 2 minutes et jeter le surnageant.
- Resuspendre les ganglions de 0,5 à 1 ml de solution de trypsine à 0,25%. Placer dans un bain-marie 37 ˚ C ou un incubateur pendant 30 minutes. Cela aidera à dissocier les cellules dans les ganglions.
- Après 30 minutes, ajouter 10 ml de milieu complet pour diluer et neutraliser la trypsine et centrifuger à 200xg pendant 2 minutes.
- Rejeter le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de milieu final.
- De plus dissocier les cellules par trituration des ganglions de haut en bas avec le feu-pipette en verre poli pâturage. Triturer les ganglions 20 fois et placer le tube sur la glace pendant quelques minutes.
- Pendant ce temps, le feu-polonais le plus pipette pour faire l'ouverture étroite (environ 2 / 3-1 / 2 mm de diamètre). Attendez quelques minutes jusqu'à ce qu'elle se refroidit et se triturer les ganglions 20 fois plus. Comme vous continuez, le milieu devient progressivement plus nuageux en indiquant que les cellules sont dissociées. Répétez cette étape une ou deux fois plus en fonction de la façon dont les cellules se dissocient. Après quelque temps, vous remarquerez que tous les ganglions sont dissociés en neurones et aucun ganglions intacts sont visibles dans le tube. Il peut y avoir du matériel tissulaire qui se dissocient pas. À ce stade, laissez reposer le tube dans la glace pendant quelques minutes afin que tous les débris non dissocié peut se déposent au fond. Maintenant recueillir soigneusement la quasi-totalité du milieu du haut et les placer dans un autre tube. Afin de s'assurer que vous ne percevez pas les débris non dissocié, laissez environ 50 ul au fond du tube. Ajouter plus de la moyenne finale au tube contenant des cellules dissociées: ce volume dépend du type de culture est une plaque à l'aide à la culture des neurones. Par exemple: si un plat de 24 puits doit être employé, puis la plaque 0,5 ganglions par puits (~ 10 000 neurones par puits) dans 0,5 ml de milieu final par puits. Une portée de rats typique se compose de 12 petits, ce qui donnerait 24 ganglions. Cela est suffisant pour un 24 graines bien-plaque et le volume total du milieu final est de 12 ml. Note: les ganglions contiennent également une petite population de cellules gliales et les autres types de cellules qui seront présents dans la culture. Utiliser Uridine/5-FDU dans le milieu final permettra d'éviter leur prolifération et de promouvoir leur mort.
- Flux cellules toutes les 48 heures en remplaçant 2 / 3 de la moyenne avec RPMI frais 1% de sérum de cheval + NGF et uridine/5-FDU. Remarque: Dans un premier temps, la culture contient des neurones sympathiques qui ont l'air pas rond avec neurites. Neurites courts deviennent visibles 24 heures après la dissection et deviennent progressivement plus dense et plus ramifiée au cours du temps.
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Discussion
Nous utilisons des rats Sprague-Dawley pour nos cultures.
Prenez le temps et les soins lors du nettoyage des ganglions. Enlever tous les débris, les vaisseaux sanguins et de graisse. Cette étape est importante pour assurer une culture qui est plus ou moins homogènes et de types de cellules étrangères. L'ajout de uridine/5-FDU éliminera largement toutes les cellules restantes non-neuronales (mitose) contaminent la culture ou au moins supprimer leur prolifération.
En outre, durant l'étape de dissociation, être patient et prendre le temps de séparer les neurones afin qu'ils ne se trouvent pas dans les grandes touffes fois qu'ils sont ensemencées sur des plaques. Ayant de grosses touffes de cellules ne donnera pas de bons résultats expérimentaux. Par exemple, de grosses touffes, il sera difficile pour les neurones à être transfectées ou infectées. Immunocoloration peut également être entravé et toutes les expériences qui nécessitent compter les neurones seront difficiles à réaliser, aussi bien.
Il n'est pas nécessaire de compléter le support avec un stylo / strep chaque fois les cultures sont alimentées. Ajout d'un stylo / strep la première fois les cellules sont étalées est suffisante. Ne ajouter uridine/5-FDU frais à la moyenne à chaque fois que le milieu est échangé.
Nous avons utilisé sympathiques culture neuronale pour étudier l'apoptose en réponse au NGF-retrait. Par exemple, dans Biswas et al. 2007 (2), neurones sympathiques ont été transfectées avec shRNA contre plusieurs molécules qui jouent un rôle important dans la promotion apoptose. Deckwerth et al. 1996 (5) ont utilisé des neurones sympathiques souris de type sauvage et des souris dépourvues du gène pro-apoptotique Bax. Ils ont examiné comment ces neurones se comportent quand ils sont privés de NGF. Figure 6 à partir de Biswas et al. 2007 (2) et la figure 3 à partir Deckwerth et al. 1996 (5) montrent ce transfectées et non transfectées cultures de neurones sympathiques ressemblent, respectivement.
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Acknowledgments
NZ tiens à remercier les membres du laboratoire Subhas Biswas, Andrew Sproul, et Ryan Willet pour sa formation en disséquant et la récolte neurones sympathiques. Soutenu par des subventions du NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
