Summary
Questo è un protocollo che descrive come isolare e colture primarie di neuroni simpatici gangli cervicale superiore (SCG) di cuccioli di ratto appena nati.
Abstract
I gangli cervicale superiore (SCG) nei ratti sono piccole, lucide, a mandorla strutture che contengono neuroni simpatici. Questi neuroni fornire innervazioni simpatico per la testa e del collo e costituiscono una popolazione ben caratterizzato e relativamente omogenea (4). Neuroni simpatici dipendono dal fattore di crescita nervosa (NGF) per la crescita sopravvivenza, differenziazione e assonale e la diffusa disponibilità di NGF facilita la loro cultura e la manipolazione sperimentale (2, 3, 6). Per queste ragioni, colture di neuroni simpatici sono stati utilizzati in una vasta gamma di studi tra cui lo sviluppo neuronale e la differenziazione, i meccanismi della morte cellulare programmata e patologiche, e trasduzione del segnale (1, 2, 5 e 6). Sezionare la SCG di ratto appena nati e dei neuroni simpatici coltura non è molto complicata e può essere imparato abbastanza rapidamente. In questo articolo, descriveremo in dettaglio come sezionare la SCG da cuccioli di ratto appena nati e di utilizzarle per stabilire le culture di neuroni simpatici. L'articolo si descrivono anche le fasi preparatorie e reagenti vari e le attrezzature che sono necessarie per raggiungere questo obiettivo.
Protocol
1. Preparazione per la dissezione:
- Selezionare il piatto appropriata cultura (10 cm o piastre 6-24-bene o bene, ecc) a seconda della natura dei vostri esperimenti, e il cappotto con coda di topo collagene 24 ore prima della dissezione. I metodi per la preparazione di ratto coda di collagene e di utilizzarlo per i piatti della cultura cappotto sono stati descritti altrove (1).
- Preparare una soluzione di tripsina 0,25% in tampone fosfato (PBS) (nessun EDTA) e filtro sterilizzare. Preparare 1 ml di aliquote e conservare a -20 ° C.
- Preparare una soluzione contenente 2,5 mM ciascuno di uridina e 5-FDU in distillata / deionizzata H 2 O. Filtro-sterilizzare e preparare aliquote di 50 microlitri. Conservare a -20 º C.
- Preparare Completa Media: terreno di coltura RPMI 1640 con 10% di siero siero di cavallo (calore inattivare incubando in un 56 º C bagnomaria per 30 minuti) e il 5% di siero fetale bovino.
- Preparare finale Medio: terreno di coltura RPMI 1640 con 1% di siero siero di cavallo + NGF (concentrazione 100ηg/ml finale) + penicillina / streptomicina (1 / 250) + 1 / 250 soluzione uridine/5-FDU (10 microM concentrazione finale) . Nota: questo mezzo dovrebbero essere costituito fresca prima di utilizzare ogni volta. Per un esperimento in un 24-ben formato piatto, si dovranno preparare 12 ml di questo mezzo. Si raccomanda di preparare un piccolo extra. NGF può essere acquistato da una varietà di fonti commerciali (vedi tabella alla fine di questo protocollo).
- Attrezzatura: Uno avrà bisogno di un microscopio da dissezione e fonte di luce. Un doppio illuminatore in fibra ottica a collo d'oca con punte di messa a fuoco è preferito. Inoltre, si dovranno pulire e sterilizzare (in autoclave o immersione in etanolo al 70% per almeno 20 minuti) i seguenti strumenti di dissezione: due coppie di micro-dissezione pinze in acciaio inox, e un paio di forbici da dissezione (anche in acciaio inox e sia da Roboz). Due aghi da siringa sterile (26 gague x 1 ½ pollici o simili) sarà anche necessario. E 'necessario configurare un'area dissezione, che è un 3 pezzi "x3" di polistirolo avvolto in un foglio di alluminio e ricoperta da una Kimwipe. Spruzzare la scheda con il 70% di etanolo per la decontaminazione. Infine, la preparazione del falò lucidato pascolo pipetta di vetro. Al fine di fuoco lucidare, prendere la pipetta di vetro e tenere la punta della fiamma per alcuni secondi, durante la rotazione. Al momento dell'ispezione, la punta sarà più liscia e l'apertura sarà più stretta. Ciò è necessario per il passaggio in cui le cellule saranno dissociate. Eseguire fuoco lucidatura in una cappa di coltura cellulare in modo che la pipetta rimane sterile.
2. Dissezione di Superiore gangli cervicali:
- Raccogliere cuccioli di ratto neonatale che sono di età P0 e P1.
- Rapidamente strofinare il cucciolo per dissezione con il 70% di etanolo per ridurre la probabilità di contaminazione.
- Rapidamente decapitare cucciolo con un paio di forbici affilate (questo passaggio non sarà mostrato nel video). Tenere la testa con pinza sterile contro garza sterile per drenare brevemente il sangue in eccesso.
- Posizionare la testa sul pad dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto e la fine caudale orientata verso di voi. La trachea reciso deve essere facilmente visibile. Utilizzare gli aghi siringa sterile per proteggere la testa mozzata al pad dissezione nel modo seguente: spingere un pin anche se il tetto della bocca nel tappetino e spingere il secondo perno se reciso la trachea nel pad. Posizionare il cuscinetto sotto il microscopio da dissezione e iniziare la dissezione.
- Utilizzando entrambe le pinze (una in ogni mano) la pelle chiara di distanza e grasso intorno alla trachea, facendo attenzione a non andare troppo in profondità. In questo modo si espongono un paio di muscoli correndo quasi parallele l'una all'altra su entrambi i lati della trachea. Nota: durante la dissezione, è necessario irrigare con acqua fredda PBS sterile o freddo, i livelli di free RPMI 1640 medium consegnato con una sterile, pipetta Pasteur per lavare via il sangue in eccesso e per mantenere l'area pulita e umida. Ciò può essere fatto solo una volta o più volte a seconda di quanto velocemente si lavora. Per un dissettore esperienza, ci vogliono solo circa 2-3 minuti per sezionare fuori un paio di gangli.
- Utilizzare le pinze per tagliare e rimuovere il muscolo da una parte per primo.
- Una volta che il muscolo viene rimosso, l'arteria carotide diventerà visibile. Spesso è la luce rosata e contiene sangue. Può apparire di colore più chiaro di altri vasi sanguigni che si può vedere nelle vicinanze e per questo motivo l'arteria carotide può non essere evidente subito. Questa arteria costeggia la trachea e si biforca in quella che sembra una "Y" a forma di nastro. Questa biforcazione è un importante punto di riferimento e, una volta individuato, sarà relativamente facile trovare il SCG.
- Recidere l'arteria alla fine più caudale e sollevarla leggermente con la pinza (l'altra estremità è ancora attaccato). Una volta fatto questo, vedrai una forma di mandorla, lucida massa alla ricerca di piccole di tessuto che è vagamente collegato al arteria proprio nel punto di biforcazione e che ha thread-come pre-e / o post-gangliari connettivi. Questo è il ganglio cervicale superiore. Usare un secondo paio di pinze con l'altra mano per staccare delicatamente e mettere in un piatto cultura piccolo (35 mm) contenenti freddo, i livelli di free RPMI 1640 medium.
- Successivamente, estrarre il ganglio sull'altro lato della trachea seguendo lo stesso protocollo.
3. Pulizia dei gangli:
- Una volta che tutti i gangli sono state asportate, dovrebbero essere liberati il più possibile di tessuti estranei.
- Sotto il microscopio dissezione, si può vedere che i gangli hanno attaccato i pezzi di carotide, tessuto adiposo o altro. Lavora con pinze in ogni mano per prendere in giro via questi materiali indesiderati. Luogo pulito gangli in una sterile 15 ml conica, tubo di polipropilene, contenente RPMI 1640 medium.
- I connettivi pre e / o post-gangliari deve essere tagliato via. Ogni ganglio ha circa 10.000 neuroni. Una volta che i neuroni sono placcati, saranno ricrescere i loro neuriti.
4. Stabilire cultura Simpatico Neuron:
- Centrifugare i gangli a 200xg per 2 minuti e scartare il surnatante.
- Risospendere i gangli in 0,5 a 1 ml di soluzione tripsina 0,25%. Posto a 37 ˚ C a bagno-maria o incubatore per 30 minuti. Questo aiuterà dissociare le cellule nei gangli.
- Dopo 30 minuti, aggiungere 10 ml di terreno completo per diluire fuori e neutralizzare la tripsina e centrifugare a 200xg per 2 minuti.
- Gettare il surnatante e risospendere in 2 ml di media finale.
- Ulteriori dissociare le cellule dei gangli triturazione su e giù con il fuoco lucidato pascolo pipetta di vetro. Triturare i gangli 20 volte e posizionare il tubo in ghiaccio per qualche minuto.
- Nel frattempo, il fuoco, lucidare la pipetta di più per rendere l'apertura più stretta (circa 2 / 3 a 1 / 2 mm di diametro). Attendere qualche minuto fino a quando si raffredda e triturare i gangli 20 volte di più. Come si continua, il medium diventa progressivamente più nuvolosa indicando che le cellule vengono dissociate. Ripetere questa operazione una o due volte più a seconda di quanto bene le cellule si dissociano. Dopo qualche tempo, noterete che tutti i gangli sono dissociate in neuroni dei gangli intatto e non sono visibili nel tubo. Ci possono essere alcuni materiali tessuto che non si dissociano. A questo punto, lasciare che il tubo di sedersi in ghiaccio per qualche minuto in modo che i detriti non dissociato possono depositarsi sul fondo. Ora attentamente raccogliere quasi tutti i media dalla parte superiore e luogo in un altro tubo. Per assicurarsi di non raccogliere i detriti non dissociato, lasciare circa 50 microlitri sul fondo della provetta. Aggiungere più del mezzo finale per il tubo contenente cellule dissociate: questo volume dipende dal tipo di targa una cultura sta usando per la cultura i neuroni. Ad esempio: se un 24-ben piatto è da utilizzare, poi piatto 0,5 gangli per bene (~ 10.000 neuroni per pozzetto) in 0,5 ml di terreno finale per pozzetto. Un disordine ratto tipico consiste di 12 cuccioli, che darebbe 24 gangli. Questo è sufficiente per seminare uno a 24 pozzetti e il volume totale dei media finale è di 12 ml. Nota: i gangli contengono anche una piccola popolazione di cellule gliali e altri tipi di cellule che saranno presenti nella cultura. Utilizzando Uridine/5-FDU nel medio finale impedisce la loro proliferazione e promuovere la loro morte.
- Nutrire le cellule ogni 48 ore, sostituendo 2 / 3 del mezzo con fresco RPMI +1% siero di cavallo + NGF e uridine/5-FDU. Nota: In un primo momento, la cultura contiene neuroni simpatici che guardano intorno senza neuriti. Neuriti breve diventano visibili 24 ore dopo la dissezione e progressivamente diventano più densi e più ramificate nel tempo.
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Discussion
Noi usiamo ratti Sprague Dawley per le nostre culture.
Prendetevi il tempo e attenzione durante la pulizia dei gangli. Rimuovere tutti, detriti vasi sanguigni e grasso. Questo passo è importante per garantire una cultura che è più o meno omogeneo e privo di tipi di cellule estranee. L'aggiunta di uridine/5-FDU in gran parte eliminare eventuali cellule rimanenti non neuronali (mitosi) che contaminano la cultura, o almeno sopprimere la proliferazione.
Inoltre, durante la fase di dissociazione, di pazienza e il tempo di separare i neuroni in modo che non si trovano in gruppi di grandi dimensioni una volta che sono seminate su piastre. Avere grandi ammassi di cellule non produrrà buoni risultati sperimentali. Per esempio, ciuffi di grandi dimensioni renderà difficile per i neuroni di essere transfettate o infetti. Immunocolorazione può anche essere ostacolata e qualsiasi esperimenti che richiedono contare i neuroni sarà difficile da realizzare, come bene.
Non è necessario integrare il supporto con la penna / strep ogni volta che vengono alimentate le culture. L'aggiunta di pen / strep la prima volta sono placcati le cellule è sufficiente. Si aggiunge uridine/5-FDU fresca al mezzo ogni volta che si scambia il mezzo.
Abbiamo usato simpatico cultura per studiare apoptosi neuronale in risposta a NGF-ritiro. Per esempio, in Biswas et al. 2007 (2), neuroni simpatici sono state trasfettate con shRNA contro diverse molecole che svolgono un ruolo importante nel promuovere l'apoptosi. Deckwerth et al. 1996 (5) hanno utilizzato i neuroni simpatici dai topi tipo selvatico e topi privi del gene pro-apoptotico, Bax. Hanno guardato come questi neuroni si comportano quando sono privi di NGF. Figura 6 da Biswas et al. 2007 (2) e nella Figura 3 da Deckwerth et al. 1996 (5) mostrare ciò che trasfettate e culture simpatico non-neuronali transfettate assomigliano, rispettivamente.
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Acknowledgments
NZ ringrazia laboratorio membri Subhas Biswas, Andrew Sproul, e Ryan Willet per la formazione lei in dissezione e la raccolta neuroni simpatici. Supportato anche da finanziamenti del NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
