16.10:

16.10: Deneysel RNAi

Experimental RNAi

JoVE Core
Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Core Molecular Biology

Experimental RNAi

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

16.11: Reporter Genes

6,017 Views

•

02:15 min

•

April 07, 2021

Overview

RNA girişimi (RNAi), transkripsiyonunu baskılayarak veya RNA bozunma sürecini aktive ederek gen ekspresyonunu inhibe eden hücresel bir mekanizmadır. Mekanizma 1998 yılında Andrew Fire ve Craig Mello tarafından bitkilerde keşfedildi. Günümüzde protozoa, sinekler, nematodlar, böcekler, parazitler ve memeliler dahil olmak üzere hemen hemen tüm ökaryotlarda görülür. Gen susturmanın bu kesin hücresel mekanizması, organizmayı genetik olarak değiştirmeden birkaç genin işlevini tanımlamak ve belirlemek için etkili bir yol sağlayan bir teknik olarak geliştirilmiştir.

RNAi Uygulamaları

RNAi, gen fonksiyonlarının analizine yardımcı olur. Örneğin, RNAi tekniği, C.elegans’ın I ve III kromozomlarının taranmasına yardımcı oldu ve hücre bölünmesi ve embriyonik gelişimde yer alan genlerin tanımlanmasına yol açtı. Bu teknoloji aynı zamanda embriyonik gelişimde, biyokimyasal sinyal kaskadlarında ve diğer temel hücresel süreçlerde önemli rollere sahip genleri tanımlamak için Drosophila melanogaster’e başarıyla uygulanmıştır. Kahve bitkilerinde, teobromin sentaz üretmekten sorumlu gen, kafeinsiz kahve bitkileri üreten bir RNA yapısı kullanılarak devre dışı bırakıldı. Araştırmalar, küçük enterferans yapan RNA’ların (siRNA), kültürlenmiş insan hücre dizilerinde insan immün yetmezlik virüsü, hepatit B virüsü ve çocuk felci virüsünün neden olduğu enfeksiyonları inhibe edebileceğini göstermektedir. Araştırmacılar ayrıca, bebeklerde ve yenidoğanlarda ciddi solunum yolu hastalığına neden olan solunum sinsityal virüsü tarafından ifade edilen genleri başarıyla yıktılar.

RNAi’nin konvansiyonel gen nakavtına göre avantajları

RNAi teknolojisini keşfetmeden önce, gen fonksiyonu, ilgilenilen genin genomdan çıkarılması ve fenotipik değişikliklerin gözlemlenmesiyle analiz edildi. Gen nakavt etme geri dönüşü olmayan bir yöntem iken, RNAi, bir genomdaki protein kodlayan genlerin büyük ölçekli susturulmasını sağlayan geri dönüşümlü bir yöntemdir. Ayrıca, tek bir nükleotid varyasyonunda bile genleri farklı şekilde susturabilen kesin bir tekniktir. Bu nedenle, bazı onkogenler gibi baskın mutantları hedeflemede yardımcı olabilir. Ayrıca, efektör moleküller eski yöntemde kullanılan oligonükleotidlere veya ribozimlere kıyasla düşük bir konsantrasyonda işlev gördüğünden, RNAi tekniği oldukça güçlüdür.

Transcript

RNA interferansı veya RNAi, hücrelerin gen ekspresyonunu susturmak için kullandıkları bir süreçtir.

Bu mekanizmada, bir enzim olan Dicer, kısa firkete RNA’yı, yaklaşık yirmi iki baz çifti uzunluğunda kısa enterferans yapan RNA’ya veya siRNA’ya böler.

Bu siRNA, RNA ile indüklenen susturma kompleksi veya RISC adı verilen bir enzim kompleksi tarafından alınır ve hedef mRNA’sı üzerinde risk montajı sırasında tek sarmallı RNA’ya dönüştürülür.

Tek sarmallı RNA, tamamlayıcı mRNA ile hibritleşebilir. RISC kompleksindeki Argonaute adı verilen bir enzim, hedef mRNA’yı parçalar. mRNA’nın bozunması, translasyon sürecini engelleyerek gen susturmasına neden olur.

RNA girişimi, araştırmacılar tarafından, kanserde rol oynadığı düşünülen bir gen olan APC gibi çeşitli genlerin işlevini incelemek için kullanılmıştır. Belirli bir mRNA transkriptini hedefleyen kısa bir firkete RNA’sını kodlayan bir vektör oluşturulur.

Bu vektör, bir geni susturmak için hücrelere veya bir organizmaya eklenebilir. Vektör, farelerin embriyonik kök hücrelerine sokulursa, dizisi konakçı genomuna entegre edilecek ve transgenik fareler üretecektir.

Bu fareler, saç tokası yapılarına katlanan eklenen diziden RNA üretir. Bu yapılar sitoplazmadaki RNAi mekanizması tarafından tanınır ve çift sarmallı RNA’ya bölünür.

RNA daha sonra tek sarmallı bir RNA olarak RISC’ye dahil edilir. RISC, bir hedef mRNA transkriptindeki tamamlayıcı diziye bağlanır ve bozunmasına neden olur.

İnaktive edilmiş bir APC genine sahip fareler, fonksiyonel bir APC genine sahip kontrol farelerine göre kolonlarında daha sık tümör geliştirir. Bu, APC’nin tümör büyümesini baskılamaktan sorumlu olma ihtimalinin yüksek olduğunu gösterir.

Key Terms and definitions

Learning Objectives

Questions that this video will help you answer

This video is also useful for