Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Bölüm I. Hazırlık cerrahi için

1. Rat cerrahi bir gün önce, tüm çözümler yapılır emin olun, ancak henüz herhangi bir enzimler katmayan. Tamponlar A, B ve yıkama tamponu depolama önce sterilite için filtre olmalıdır. Tamponlar 4 ° C'de muhafaza edilmelidir
2. 6-iyi doku kültürü plakaları 10-20 mg / ml 2 ml 1XSFM laminin de önceki gün kaplanmış olmalıdır ve 37 ° C CO ₂ kuvöz içinde saklanmalıdır.
3. Ameliyatın yapıldığı gün,% 70 etanol ile kelepçe, makas, forseps ve sterilizasyon cerrahi aletler hazırlamak ve onları kağıt havlu üzerinde kurumaya bırakın.
4. 0.5 mL Heparin Çözümü (90 U / ml) ile dolu bir şırınga 1 ml hazır hale getirilir.
5. Şimdi ters peristaltik pompa kullanarak,% 70 etanol ile çalışan perfüzyon aparatı yıkamak için iyi bir uygulamadır. Bir kez etanol ile durulama bitmiş cihazın, çift distile su ile temizleyin, durulayın ve akış sonunda, 37 ° C'lik su banyosuna yerleştirilir bir beher toplanan Tampon A. ile durulayın.
6. Tampon A ve sol şırınga tüp 40 ml, 40 ml Tampon B. ile temizlenmelidir perfüzyon cihazı hazırlamak için doğru şırınga tüp doldurmak
7. Tampon bir aparat üzerinden akmasına izin vererek kateter ucu Başbakan perfüzyon tüp. Tampon, 40 ml seviyesine şırınga Dolum. Bu adımdan sonra tüp içinde sıkışıp hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
8. Şimdi, perfüzyon boru Tampon B. ile astarlanmalıdır olduğunu tampon şırınga stopcock vanasını kapatın ve örneğin Tampon B işlemi tekrarlayın
9. Son olarak, perfüzyon aparat Tampon B valfli kapak açık kalan, ancak akışı ile IV hattı regülatör kullanarak durdu.
10. Toplama beher akış olsa tampon atın.
11. Ameliyat öncesi yapılacak en son şey, diğer çözümlerin bir gün önce filtre gibi enzim çözeltisi stok solüsyonu gerekli enzimleri eklemek ve daha sonra filtre. Süzülür sonra, bu çözüm oda sıcaklığında bırakılabilir.

Bölüm II. Sıçan kalp diseksiyonu

1. Takiben standart bir protokol, bir gaz odası İsofluranın ile sıçan euthanize.
2. % 70 etanol ile toraks kesi alanı sterilize edin.
3. Açık göğüs makas kullanarak ve kalp maruz.
4. 0.5 mL Heparin çözüm (90 U / ml) ile sol ventrikül enjekte edilir.
5. Buz Tampon B. aort sağlam, yerinde büyük bir kısmı kalp çıkarın

Bölüm III. Miyositler izolasyon

1. Aşağıdaki yordam, düzgün yapıştırılır ise tipik bir sıçan kalp çubuk şeklinde miyositler yüksek bir fraksiyonu (ölü yuvarlak hücrelere karşı) boyun eğmek zorundadır .
2. Başlamak için, kateter aort kelepçe. Kateterin ucu çok uzakta, koroner arter yoluyla kalbin iyi perfüzyon sağlamak için kalbin içine itti olmamalıdır.
3. Kelepçeli, bir dikiş ile kateter aort bağlar.
4. Sonra, hızlı bir damla oranı (~ 60 damla / dk) ve kalp yıkamak için izin Tampon B izin IV hattı regülatör açın.
5. Tampon B yıkama sırasında, kulakçıklar ve kalp yapışan herhangi bir yağ ya da akciğer dokusunda kaldırmak için küçük makas ve forseps kullanabilir.
6. Tampon B tamamlandıktan sonra, Tampon A. akım anahtarı
7. Tampon 5 dakika boyunca akmasına izin olsa da, birkaç küçük görevleri hızlı bir şekilde yapılmalıdır.
8. İlk olarak, 37 ° C su banyosunda Enzim Çözüm sıcak.
9. Son olarak, Tampon şırınga (ama hala mevcut boru) boşaldığında, şırınga Enzim Çözüm 50 ml yük bir perfüzyon aparat
10. Enzim Çözüm perfuses kalp kadar, artık tüm su banyosu (pipetleme) toplama beherine flow-through atmak için gerekli.
11. Enzim Çözüm kalp perfuses, şırınga A. doldurmak için toplama beher enzim çözeltisi aktarmak için kurulur peristaltik pompa aktive
12. Enzim çözeltisi, 10 dakika süreyle kalp akmasına izin verin. Kalp sindirir gibi, bu şişirilmiş aramaya başlar.
13. Şırınga içinde enzim çözeltisi 0,1 M CaCl ₂ 37.5 mcL ekleyin 0.1 mM Ca ² etkili bir konsantrasyon elde ^etmek.
14. 10 dakika için 0.1 M CaCl ₂ ek bir 50 mcL şırınga A ekleyerek 0.2 mM kalsiyum konsantrasyonunu artırmak ve perfüzyon bir 10 dakika daha devam edelim sonra.
15. Ventriküller kesilmiş ve 20 mL Enzim Çözüm içeren küçük bir steril beher transfer.
16. Beher 0,1 M CaCl ₂ 40 mcL daha ekleyerek 0.4 mM Kalsiyum konsantrasyonu artırır.
17. Yavaşça, küçük steril makas bir çift ile 10 veya daha fazla parçalar halinde kalp kıyma.
18. 37 5 dakika boyunca beher ° C'de nazik sallanan.
19. 40 mL 0.1 M CaCl ₂0.6 mM Ca ^{2 +} etkin konsantrasyon vermek ve kalp adet plastik bir transfer pipetlemeyin 3-5 kez yavaşça çiğnemek.
20. 37 ek bir 5 dakika inkübe sonra ° C, 40 ml 0,1 M CaCl ₂ ve yavaşça eskisi gibi çiğnemek.
21. Ayrı sindirilir tek miyositler olmayan sindirilir steril 500 mikron mesh yoluyla filtrasyon kullanarak bağ dokusu.
22. Hücrelerin oda sıcaklığında 10 dakika, 50 ml tüp yerleşmek için izin verin.
23. Bir transfer pipetlemeyin ile süpernatant atın.
24. Yıkama Tamponu # 1 yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon ve hücrelerin oda sıcaklığında 10-20 dk yerleşmek için izin.
25. Hücrelere yerleşen olsa da, bu kez ters bir mikroskop altında süspansiyon hücrelerinin kalite ve canlılığını değerlendirmek için bir fırsat olarak küçük bir kısım almak ve kullanmak. İyi bir hazırlık net desenli hücreleri gibi bir çubuk yüksek oranda (>% 80) sahip olacak.
26. Hücreleri yerleştikten sonra, Yıkama Tamponu # 2 supernatant ve yavaşça tekrar süspansiyon hücreleri atın. Hücrelerin oda sıcaklığında dinlendiriniz, yine 10-20 dakika sürebilir ve süpernatantı atmak gerekir.
27. Yıkama işlemi tekrarlayın bir kez Yıkama Tamponu # 3, ve hücrelerin daha fazla kültür için hazır olacak.

Bölüm IV. Miyosit hücre kültürü

1. % 5 serum Medya yavaşça hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Hücrelerin doku kültürü tabak aktarmadan önce, 1x SFM plakaları yıkayın. 3-5 saat boyunca CO ₂ doku kültürü inkübatör istenen yoğunluk ve inkübe hücrelere aktarın.
2. 1x SFM medya geçin.
3. Hücreleri dört gün kadar kültürlü ve deneyler için gerekli olabilir.

Bölüm V. Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç

Protokolü doğru yapılır inverted mikroskop altında% 70 den fazla canlı kalp miyositler olmamalıdır.

Tablo 1: 1 L Çözüm tarifi 10X Ca ^{2 +-KH} Tampon:

Tablo 2: 1 L Tampon A Çözüm tarifi:

100 ml 10X KH tampon 1.98 g glukoz ve glukoz ile yakın fizyolojisi durumu (~ 300) ozmolarite ayarlayın son hacmi 1 L. getirmek. NaOH ile pH 7.4 'e getirin.

Tablo 3: Enzim Tamponlar Çözüm tarifi

Tablo 4: 25X BDM / Taurin / BSA (B / T / B) Çözüm tarifi

Tablo 5: Tampon B ve Yıkama Tamponlar Çözüm tarifi

Tablo 6: Kültürleme Medya İçin Çözüm Tarif

A critical step is the speed with which the isolated heart is hung up on the perfusion system. The length of the enzymatic digestion period may be a little different for each rat. The adjustment depends on how soft the heart becomes after the regular period of digestion. The slowly recovery of Ca²⁺ after enzyme digestion is essential for obtaining Ca²⁺-tolerant healthy cells.

For guinea pig, the protocol is the same except hyaluronidase is used instead of Protease XIV. Typically, we find the that initial percentage of living cells is lower for guinea pig compared to rat, although they survive just as long in culture.