Ultrason Kılavuzluğunda İmplantasyon: Pankreatik Duktal Adenokarsinom Hücrelerini Yetişkin Bir Fareye İmplante Etme Tekniği

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve jove veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. Farelerin Cerrahi Öncesi Hazırlığı

NOT: Bu adımın işlemden 24 saat önce yapılması önerilir.

1. Deney fareleri içeren kafesleri 37°C'ye ayarlanmış bir ısıtıcıya yerleştirin.
2. Yeni, temiz kafesler edinin ve 37°C'ye ayarlanmış ikinci bir ısıtma platformuna yerleştirin.
3. Biyolojik güvenlik kabinini, indüksiyon odasını ve ultrason (US) aşamasını sterilant ile iyice temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
4. ABD aşamasının ısıtma fonksiyonunu 37°C'ye getirin.
5. Anestezi makinesini açın: tüp ayırıcı üzerindeki kadranları, hava akışı yalnızca indüksiyon odasıyla sınırlı olacak şekilde ayarlayın. Oksijen tankını açın ve akış hızını 1 L/dk'ya ayarlayın. İzofluran buharlaştırıcıyı% 2-3'e getirin.
6. İndüksiyon odasına tek bir fare yerleştirin. Artık hareket etmeyene ve nefes alma yavaşlayana kadar fareyi izleyin.
7. Ayırıcı üzerindeki kadranları, hem indüksiyon odasına hem de burun konisine hava akışına izin verilecek şekilde ayarlayın. Fareyi indüksiyon odasından hızla hareket ettirin ve ağzı burun konisinde olacak şekilde sıcak ABD sahnesinde ventral yaslanacak şekilde yatırın.
8. Ayak parmağını sıkıştırmaya yönelik herhangi bir refleksif tepkiyi gözlemleyerek indüksiyon seviyesini test edin. Hiçbiri yoksa, fare epilasyon için hazırdır.
9. Doku dehidrasyonunu önlemek için her iki göze de az miktarda göz kayganlaştırıcı (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin. Fareyi, sahnede sırt yaslanması için çevirin. Karnın maruz kalmasını en üst düzeye çıkarmak ve fareyi sahneye sabitlemek için üst ve alt ekstremiteleri kağıt bantla sahneye nazikçe yapıştırın.
10. Karnın sol üst kadranına bol miktarda tüy dökücü krem uygulamak için steril bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. Tüy dökücü dalağın genel bölgesinde uygulanmalı ve orta hatta doğru uzanmalıdır. Yaklaşık bir dakika oturmasına izin verin.
11. Tüy dökücü kremi silmek için pamuk uçlu aplikatörün diğer ucunu nazikçe kullanarak epilasyon derecesini test edin, kolayca çıkarıldıktan sonra karnı kuru bir gazlı bezle silerek temizleyin. Daha sonra temiz bir gazlı bez tabakasını az miktarda ılık tuzlu su ile ıslatın ve tüy dökücü maddeyi tamamen çıkarmak için alanı bir kez daha silin. Kimyasal yanık olasılığını azaltmak için fare cildine 2 tam dakika doğrudan temas etmeyin.
12. Tüyler karından yeterince çıkarıldıktan sonra, fareyi ısıtıcı üzerinde yeni ve temiz bir kafese geri koyun.
13. İlk hayvan ABD sahnesinde epilasyon işlemine tabi tutulurken, bir sonraki hayvan indüksiyon odasına eklenebilir.
14. Bir sonraki fare kafesini uyuşturmadan önce, izofluranı kapatın ve indüksiyon odasını oksijenle yıkayın. İndüksiyon odasını ve US kademe/burun konisini sterilant ile temizleyin. Tüm kafesler ve fareler epilasyon uygulanana kadar 1.5-1.14 adımlarını tekrarlayın.
    not: Hayvanların implantasyondan önceki bir süre geçici olarak gıdaların kesilmesi ile oruç tutulmasının, mide ve bağırsaklarda sindirilmemiş gıdalar nedeniyle karın organlarının görme tıkanıklığını en aza indirgediği düşünülebilir (12-24 saat). Su kısıtlaması önerilmez. Hayvanlar açlık tutuyorsa, dehidrasyonu önlemek için tümör enjeksiyonunu takiben 1 mL ılık (37 ° C), steril salin enjeksiyonu ile tedavi edilmeleri önerilir.

2. PDA hücrelerinin ultrason eşliğinde implantasyonu

>NOT: Tüm ultrason prosedürleri, ultrason görüntüleme makinesi ve yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Dönüştürücünün merkez frekansı 40 MHz ve bant genişliği 22-55 MHz'dir.

1. Ultrason platformunu, platform yüzeyi zemine paralel olacak ve araştırmacı hayvanın sol tarafına, hayvanın başı sağa bakacak şekilde ayarlayın. Dönüştürücü konumunu, enine bir karın görüntüsü elde edilecek şekilde ayarlayın (Şekil 1A).
2. Enjekte edilecek fareyi adım 1.1-1.8'de açıklandığı gibi uyuşturun. Fareyi adım 1.9'da açıklandığı gibi ABD platformunda sabitleyin.
3. Karnın tüysüz kısmına bol miktarda ılık (37 ° C) ultrason jeli uygulayın.
4. Farenin karnına temas etmek için dönüştürücüyü yavaşça indirin. Pankreas net bir şekilde görünene kadar dönüştürücüyü gerektiği gibi ayarlayın. Karın boşluğunun doğru bir şekilde yönlendirilmesini sağlamak için sol böbreği ve dalağı bulun.
   not: Dönüştürücü konumu, karnın sol tarafına erişime izin verecek şekilde değiştirildiğinden, sahne kontrolleri üzerindeki X ve Y ekseni artık ters çevrilmiştir.
5. 25μL tümör hücresi süspansiyonu ile 29G x 1/2" insülin şırıngası (Malzeme Tablosuna bakınız) yükleyin. Karın duvarındaki tümör hücresi tohumlanmasını en aza indirmek için enjeksiyondan önce iğne ucunu steril alkol hazırlama pedi ile silin.
6. Künt kenarlı forseps kullanarak, istenen enjeksiyon bölgesinde gerginliği artırmak için cildi ve periton duvarını kavrayın. Şırıngayı ultrason platform yüzeyine yaklaşık 25 ° -45 ° açıyla tutarak, iğneyi cilt ve periton duvarı boyunca yavaşça ilerletin. Bir sonraki adıma geçmeden önce iğnenin periton duvarından delindiğini onaylayın. İğne periton duvarını delerken küçük bir patlama hissedilmelidir.
7. Ultrason görselleştirmesi altında, iğneyi doğrudan pankreasa yönlendirin (Şekil 1B-C). Şırınga namlusunu hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek iğnenin pankreas dokusu içinde olduğunu onaylayın. Yerleştirme doğruysa, şırınga namlusu hareket ederken iğne ucu pankreas dokusu içinde kalacaktır.
8. Tümör hücrelerini yavaşça enjekte edin ve pankreas içinde bir sıvı bolus oluşturarak hücrelerin istenen yere implante edildiğini onaylayın (ultrason ekranında görülebilir, Şekil 1D).
   not: Pistona basarken bir miktar direnç hissedilmelidir. Pankreası birden çok kez delmemeye dikkat edin, çünkü bu karın boşluğuna sızıntı olasılığını artırır.
9. Tam süspansiyon hacmi enjekte edildikten ve pankreasta bir sıvı bolusu görüldükten sonra, iğneyi birkaç saniye boyunca çok hareketsiz tutun. Enjekte edilen hücreleri rahatsız etmemeye büyük özen göstererek iğneyi fare karnından yavaşça geri çekin.
10. Fareyi temiz, sıcak bir kafese koyun ve farenin anesteziden tamamen kurtulduğundan emin olun. Bu işlemi tüm hayvanlar için tekrarlayın.
11. Bir sonraki fareyi uyuşturmadan önce, indüksiyon odasını ve US aşaması/burun konisini sterilant ile temizleyin.
12. Tüm fareler enjekte edilene kadar 2.2-2.11 adımlarını tekrarlayın.

Şekil 1: PDA hücrelerinin murin pankreasına ultrason eşliğinde implantasyonu. (A) Karın organlarının yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü elde etmek için kullanılan farenin, ultrason aşamasının ve ultrason probunun oryantasyonu. Fare karnının sol üst çeyreğine kolay erişim sağlamak için sahne ve platformun standart yönden 90° döndürüldüğünü unutmayın. (B) Böbrek, dalak ve pankreasın tanımlanmasını gösteren ultrasonografik görüntü. Burada enjeksiyon iğnesi farenin karnına karşı konumlandırılır. (C) Fare pankreasındaki iğneyi gösteren ultrasonografik görüntü. (D) Tümör hücrelerinin pankreasa kontrollü enjeksiyonunu takiben enjeksiyon bölgesindeki (mavi ile özetlenmiş) kabarcığı gösteren ultrasonografik görüntü. (E) Ultrason eşliğinde enjeksiyondan sonra pankreasta PDA hücreleri içeren sıvı bolusunu ortaya çıkaran laparotomi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.