Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Tümör Nakli için Hazırlık
- Hayvan Barınağı
- Jenerik C57BL/6 fareleri ticari bir damızlık satıcısından edinin.
- Ev fareleri (5) aşağıdaki koşullarda ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde: Sıcaklık: 20–26 °C; nem %30–70; aydınlatma döngüsü: 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık.
- Haftalık olarak değiştirilen mısır koçanı yataklarını kullanın.
- Diyet için, tüm çalışma süresi boyunca ışınlama ile sterilize edilmiş kuru granül gıda sağlayın.
- Su için, hayvanlara steril içme suyuna ücretsiz erişim sağlayın.
- Donör tümör fragmanı hazırlığı
- Tümör taşıyan donör farelerin terazi kullanarak tartılarak vücut ağırlığını (BW) ve kaliper ölçümü ile tümör hacmini (TV) izleyerek başlayın.
- TV 500-1.200mm'ye ulaştığında 3, hayvanı protokole göre biyolojik tehlike başlığı içinde ötenazi yapın.
- İyodofor çubukları kullanarak tümörün etrafındaki cildi sterilize edin.
- Tümörü protokole göre cerrahi olarak çıkarın.
- Sonlandırmadan önce palpe edilebilen tümörlerin varlığını görsel olarak ve palpasyonla inceleyin.
- Sonlandırma için, önce fareleri onaylanmış protokole göre ötenazi yapın ve karnı açın ve pankreası tümörler için görsel olarak inceleyin.
- Tümörü ölüm sonrası cerrahi ile kesin ve soğuk PBS'ye ekleyin. Tüm hayvanları, kullanılacak karbondioksitin verilmesi için bir portu olan özel bir kapağı olan temiz, şarjsız, yarı saydam bir ötenazi odasına yerleştirin.
- Hayvana en az sıkıntı ile hızlı bilinç kaybı yaratan bir akış hızında gazı odaya boşaltın. CO2 için optimum akış hızı yaklaşık 2–2,5 L/dk olmalıdır.
- Tüm hayvanların yeterli gaz konsantrasyonları almasını ve ötenazi prosedürü sırasında bilincini geri kazanmamasını sağlamak için ötenazi prosedürü sırasında her hayvanı görsel olarak gözlemleyin.
- Bir hayvanın iyileşme olasılığını en aza indirmek için görünür klinik ölümden sonra en az 1 dakika gaz akışını koruyun (apneik ancak ölmediyse).
- Bitişik tümör olmayan dokuları çıkarın. Temizlenen tümör hızlı bir şekilde fotoğraflanabilir.
Tümör dokularını RPMI-1640'a koyun ve ayrışmadan önce buz üzerinde tutun.
not: Hayvan leşleri torbalanır ve çıkarılmayı beklemek için uygun dondurucuda saklanır.
- Tümörü 20 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin (hayvanlara ötenazi yapmadan önce ortamı veya tamponu 4 ° C'ye önceden soğutun).
- Kirletici kan varsa, tümörü başka bir Petri kabına aktarın ve tümörü PBS ile yıkayın.
- Tümörü ikiye bölün, fazla deri, damar, kalsifikasyon ve/veya nekrozu çıkarın.
- Sadece sağlam tümör parçalarını seçin ve bunları steril bir 50 mL santrifüj tüpüne yerleştirin ve 20 mL PBS ekleyin, ardından tüpü farmakoloji çalışmaları için ayrı bir hayvan odasına taşıyın.
2. Pankreas ortotopik implantasyonu
- Anestezi ve Analjezi
- 2 mL ketamin enjeksiyonu ve 0.42 mL ksilazin enjeksiyonu (20 mg / mL) kullanın (20 mg / mL), 0.06-0.1 mL / 20-25 g vücut ağırlığı doz hacminde 5.91 steril enjeksiyon suyu veya salin içinde karıştırılmış.
NOT: Hayvan refahına göre, analjezi hem operasyon öncesi hem de sonrası gereklidir. 0.05–0.1 mg buprenorfin /kg, SC. İlk doz operasyon öncesidir ve daha sonra operasyondan sonra her 4 saatte bir sürekli olarak 3 kez dozlanır.
- Ortotopik implantasyon için cerrahi operasyon
- Fareleri intramüsküler enjeksiyon (IM) yoluyla uyuşturun. Alıcı hayvanı% 1'lik bir burun konisi tarafından korunan% 5 izofluran ile uyuşturun. Hayvan gevşemeye başlayacak, doğru refleksini kaybedecek ve sonunda hareketsiz hale gelecektir. Bu anestezi derinliğinde, ağrılı uyaranlarla kolayca uyandırılabilirler; Ağrıya bu tür tepkiler gelmeyene kadar anestezinin derinleşmesine izin verin.
- Hayvanlar tamamen uyuşturulduktan sonra, fareleri sağ yanal pozisyonda bir deney tahtasına sabitleyin.
- Fareleri doğru yanal pozisyonda tutun. Dalak çevresindeki cildi iyotla dezenfekte edin, ardından %75 etil alkol ile iyodinden arındırın.
- Dalağın orta noktasını bulun ve dalağı ortaya çıkarmak için karın üzerinde 1 cm'lik dikey bir kesi yapın.
- Dalağın altındaki pankreas dokusunun bir kısmını düz uçlu cımbızla nazikçe çekin ve tohum fareden alınan bir fare homogreft tümör parçasını alıcı farenin pankreasına 9-0 Emilebilir cerrahi sütür ile dikin.
- Karnı çift dikişle 6-0 ipek dikiş ile kapatın. Kompresyon ile homeostaz elde edin.
- Tümör implantasyonunu bitirdikten sonra, ne kanama ne de tümör dokusu sızıntısı olmazsa, hayvanları sıcak bir kafeste tutun.
- Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci geri kazanana kadar hayvanı izleyin; anesteziden tamamen iyileştikten sonra hayvanı hayvan odasına geri koyun. Dalağın yakınındaki karnı palpe ederek tümör taşıyan fareleri izleyin ve ortotopik tümörleri taşıyan fareleri seçin.
3. Tümörlü Farelerin Sağlık İzleme
- Günlük su ve yiyecek tüketimini kontrol edin.
- Bakımsız bir tüy, topaklar, incelik, anormal nefes veya asit için fare görünümünü inceleyin.
- Karaciğer veya dalakta spontan tümör olup olmadığını kontrol etmek için karnı palpe edin.
- Fareleri bir terazi kullanarak haftalık olarak tartın.
- Aşağıdaki klinik belirtilerden herhangi biri gözlenirse, fareler numune toplama ve nekropsi için feda edilir: BW kaybı >% 20); bozulmuş hareketlilik (yemek yiyip içememe); önemli assit ve genişlemiş karın nedeniyle normal hareket edememe; solunumda çaba.
