Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Abstract

Kaynak: Jia, Z. ve diğerleri, In Vitro Kondrosit Farklılaşmasının DNA Metilasyon Seviyesini Ölçen 5 mC Nokta Blot Testi.J. Vis. Uzm.(2017)

Bu videoda, DNA örneklerinin bir naylon zar üzerinde lekelenmesi ve ardından monoklonal antikorlar kullanılarak görselleştirme yoluyla insan kondrositlerindeki DNA metilasyon seviyesini in vitro olarak belirlemek için nokta lekeleme tekniği açıklanmaktadır. Bu, kültürün çeşitli aşamalarında kondrositlerin fenotipini belirlemeye yardımcı olur.

Protocol

1. İnsan Eklem Kıkırdak Dokusu Toplanması ve Kondrosit Kültürü

1. Malzemelerin hazırlanması
   1. Dulbecco’nun %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş modifiye kartal ortamı (DMEM) ortamını hazırlayın. 1 mg / mL kollajenaz II,% 0.25 tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve bir hücre süzgeci (40 μm naylon) hazırlayın.
2. İnsan eklem kıkırdak dokusu toplanması
   1. Travma sonrası donör hastaların diz eklemlerinden eklem kıkırdağını izole edin. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onay alın.
   2. Steril bir neşter kullanarak kıkırdağı 1-2 mm’lik³ parçaya bölün ve kıyılmış kıkırdaktan kondrositleri DMEM’de 37 ° C’de 12-16 saat boyunca 1 mg / mL kollajenaz II ile sindirin.
   3. Elde edilen hücre süspansiyonunu bir hücre süzgecinden (40 μm) süzün ve PBS ile iki kez yıkayın.
   4. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM’de 20.000-30.000 hücre / cm² yoğunluğunda bir hemositometre ve tohum ile hücreleri sayın.
   5. 37 ° C’de bir inkübatörde kültür.
3. Tek katmanlı kondrosit genişlemesi
   1. % 0.25 tripsin-EDTA kullanarak alt birleşen hücreleri hasat edin ve 6.600 hücre /^cm2 yoğunluğunda yeniden plakalayın. Ortamı haftada iki kez değiştirin.
   2. Altı pasaja kadar tek tabakalar halinde kondrositleri kültürleyin ve 1, 2, 3, 4 ve 5 pasajlarında değerlendirin.

2. Genomik DNA (gDNA) Ekstraksiyonu

1. Hücreleri toplayın ve 10 milyon hücre başına 500 μL lizis tamponunda (15 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0,% 0.5 SDS, 200 μg / mL RNaz A) yeniden süspanse edin. Pipetleme ve hızlı ters çevirme ile hücreleri yeniden süspanse edin ve ardından 37 °C’de 1 saat inkübe edin.
2. 160 μg/mL hücre lizatı konsantrasyonunda proteinaz K ekleyin ve karışımı kuvvetlice ters çevirin. 55 ° C’de 6 saat inkübe edin.
3. Numuneye bir hacim Tris pH 7.9 doymuş fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Numuneyi yaklaşık 20 saniye boyunca elinizle iyice girdap haline getirin veya sallayın.
4. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13.000 × g’da santrifüjleyin. Üst sulu fazı çıkarın ve tabakayı yeni bir tüpe aktarın.
5. Fenolü uzaklaştırmak için eşit hacimde kloroform ile ekstrakte edin ve üst sulu fazı taze bir tüpe aktarın.
6. 0.1 numune hacmi 3 M sodyum asetat pH 8.0 ve 2 hacim %100 etanol ekleyerek DNA’yı çökeltin.
7. gDNA’yı çökeltmek için tüpü gece boyunca -20 °C’de saklayın.
8. Numuneyi 4 °C’de 10 dakika boyunca 16.000 x g’da pelet gDNA’ya santrifüjleyin.
9. Numuneyi %70 etanol ile üç kez yıkayın ve 4 °C’de 13.000 x g’da 2 dakika santrifüjleyin.
10. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından havayla kurutun. DNA’yı 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA’da yeniden süspanse edin.

3. DNA Metilasyon Profili Oluşturma

1. Üreticinin protokolüne göre, toplam 500 ng genomik DNA kullanarak bisülfit dönüşüm reaksiyonunu gerçekleştirmek için bir DNA metilasyon kiti kullanın. 10 μL elüsyon tamponunda (50 ng/μL) elute edin.
2. Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak DNA metilasyon profilini çıkarın.

4. Nokta Leke Analizi

1. İzole edilen DNA’yı (numune başına 1 mg) 95 ° C’de 10 dakika boyunca 0.1 M NaOH içinde denatüre edin. DNA’yı buz üzerinde 1 M NH₄OAc ile nötralize edin ve ardından iki kat seyreltin. Seri seyreltilmiş genomik DNA’nın 2 μL’sini bir N ⁺ zarı üzerinde tespit edin.
2. Membranı 80 °C’de 30 dakika kurulayın.
3. N ⁺ membranını 1 saat boyunca TBS-T’de% 5 BSA’ya batırarak spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke edin. Oda sıcaklığında reaksiyon odası olarak 10 cm’lik bir Petri kabı kullanın.
4. TBST’de 5 dakika üç kez yıkadıktan sonra, zarı gece boyunca 4 ° C’de TBS-T’de bir fare anti-5-metilsitozin (5-mC) monoklonal antikoru (1: 1.000) ile inkübe edin.
5. Membranı TBS-T’de üç kez 5 dakika boyunca yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBS-T’de ikincil bir antikor, HRP konjuge koyun anti-fare immünoglobulin-G (IgG) (1: 5.000) ile inkübe edin.
6. Membranı TBS-T’de üç kez 5 dakika yıkayın.
7. Enzim substratını zara ekleyin ve 5-10 dakika inkübe edin. İkincil antikor sinyalini, üreticinin talimatlarına göre bir kemilüminesans kiti kullanarak görselleştirin.

Materials

<strong>Reagents</strong>
DMEM&nbsp;&nbsp;	Gibco Inc.	11965&ndash;092	Warm in 37 &deg;C water bath before use
Phosphate-Buffered Saline(PBS)	HyClone Inc.	SH30256.01B	D-PBS, free of&nbsp;Ca2+/Mg2+
FBS	Gibco Inc.	10099-141
0.25%Trypsin/EDTA	Gibco Inc.	25200-056
1%Penicillin-Streptomycin	Gibco Inc.	15140-122
Chloroform	Mallinckrodt	4440
Isoamyl Alcohol	Sigma	I-3643
Phenol	Gibco BRL	15513-039
Proteinase K	Gibco BRL	24568-2
TAE buffer&nbsp;	Bio Whittaker	16-011V
Distilled Water	Gibco BRL	15230-170
1 M Tris-HCl	Biosharp Inc.	BL514A
Tween20	Biotopped Inc.	C58H114O26
BSA	Proliant Inc.	68700
Collagenase, Type II	Sigma-Aldrich	C6885
<strong>Equipment</strong>
Cell Strainer (40&mu;m nylon)	FALCON Inc.	352340
Hemocytometer	ISOLAB Inc.	075.03.001
Falcon 100 mm&nbsp; dish	Corning	353003
Centrifuge Tubes	TPP AG	91050	Gamma-sterilized
High-speed centrifuge	Eppendorf	5804R
ThermoMixer	MIULAB	MTH-100
Carbon dioxide cell incubator	Thermo scientific	3111
Chemi-imaging Analyse System	UVITEC Cambridge	ALLIANCE