Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Abstract

Kaynak: Tirumalai, V., et al. Bitki MikroRNA’larının Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi için RNA Blot Analizi. J. Vis. Exp. (2020)

Bu videoda, bitki dokusundan ekstrakte edilen toplam RNA’dan mikroRNA’ları (miRNA’lar) tespit etmek ve ölçmek için bir hibridizasyon tekniği olan kuzey blotunu gösteriyoruz.

Protocol

1. Jel elektroforezi

1. Ön çalışmayı durdurun ve numune yüklemeden önce kuyucukları yıkayın.
2. Numuneleri 98 °C’de 1 dakika ısıtın ve numuneleri kılcal uçlar kullanarak sıcak olarak kuyuya yükleyin. Ucu kuyunun dibine yerleştirin, böylece numune kuyucukta ince bir tabaka kaplar.
3. Tüm numunelerin eksiksiz yüklenmesi. RNA on yıl işaretleyicisinin yüklenmesini içerir.
4. Bromofenol mavisi boya neredeyse tamamen akana kadar jeli 80 V’ta çalıştırın. Bromofenol mavisi, %15 denatüre edici akrilamid jelde 10 bp’de çalışır.

2. Elektro-lekeleme için hazırlık

1. N+naylon membranı bir cam plaka boyutlarında kesin ve membranı sağ üst köşesinden bir HB kalemle etiketleyin.
2. Membranı, etiketli tarafı su yüzeyine bakacak şekilde steril su yüzeyine nazikçe yerleştirin. Membranı 15 dakika önceden ıslatın.
3. 4 adet kurutma kağıdı I’i fiber ped boyutlarında kesin.
4. Kasetin gri tarafını temiz bir tepsiye yerleştirerek jel sandviçi hazırlayın.
5. Fiber pedi önceden ıslatın ve kasetin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıklarını çıkarın.
6. Bir parça kurutma kağıdını 1x TBE’de önceden ıslatın ve fiber pedin üzerine yerleştirin. Kağıdın üzerine plastik bir pipet sararak hava kabarcıklarını çıkarın. Başka bir parça önceden ıslatılmış kurutma kağıdı yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarın.
7. Jeli çalışan kasetten dikkatlice çıkarın ve ilk yüklenen RNA örneği sağa doğru olacak şekilde sandviç kurulumunun üzerine yerleştirin.
8. Önceden ıslatılmış zarı yavaşça 1x TBE’ye batırın ve etiketli tarafı aşağı bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Hava kabarcıklarını gidermek için açın.
9. Bir parça kurutma kağıdını batırın, zarın üzerine koyun ve hava kabarcıklarını çıkarın. Başka bir kurutma kağıdı batırın, sandviç kurulumunun üzerine yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarın.
10. Kurulumun üzerine önceden ıslatılmış bir fiber ped yerleştirerek ve kaseti sıkıca kapatarak sandviçi tamamlayın.
11. Transblot kasetini modüle yerleştirin ve lekeleme işaretine kadar 1x TBE, pH 8.2 doldurun.
12. 10 V’ta, gece boyunca 4 °C’de aktarın.
13. Transferden sonra, nemli zarı bir kağıt kağıda yerleştirin ve 254 nm UV ışığı (120.000 μjoule/cm²) ile ışınlayarak RNA’yı hemen zara çapraz bağlayın. Çapraz bağlı leke, daha fazla hibridizasyon için 4 °C’de saklanabilir.

3. Radyoaktif işaretli probun hazırlanması

1. Tespit edilecek küçük RNA’yı tamamen tamamlayan bir prob tasarlayın.
2. Bileşenleri Tablo 32‘de verilen tarife göre birleştirerek 5’ ucunda ƳP1ATP (BRIT’ten elde edilen) kullanarak probu sonlandırın.
3. Yukarıdaki reaksiyon karışımını 37 °C’de 30 dakika inkübe edin.
4. Üreticinin protokolüne göre bir Sephadex G-25 sütunu kullanarak etiketlenmemiş ƳP32ATP’yi probdan ayırın.

4.Lekenin hibridizasyonu

1. Çapraz bağlı lekeyi, RNA tarafı üste bakacak şekilde bir hibridizasyon şişesinin içine yerleştirin.
2. Ultra hassas hibridizasyon tamponunu kuvvetlice karıştırın, 10 mL ekleyin ve lekeyi 35 °C’de tutulmuş bir hibridizasyon fırını içinde rotasyonla inkübe edin.
3. 20 dakika boyunca ön hibridizasyon yapın.
4. Şişeyi fırından çıkarın ve etiketli probu nazikçe hibridizasyon tamponuna ekleyin.
5. Lekeyi 35 °C’de, 12 saat döndürerek hibritleştirin.
6. Hibridizasyondan sonra, hibridizasyon çözeltisini dikkatlice 15 mL’lik tüpe aktarın. Bu çözelti yeniden kullanılana kadar 4 °C’de saklanabilir.
7. 2x SSC tamponu artı %0,5 SDS ekleyerek fazla hibridizasyon solüsyonunu çıkarmak için lekeyi 2 dakika hızlı bir şekilde yıkayın. Çözümü atın.
8. Lekeyi 2x SSC tamponu artı 35 ° C’ye% 0.5 SDS ile 30 dakika döndürerek inkübe edin.
9. Lekeyi 0,5x SSC tamponu artı 35°C’de %0,5 SDS ile 30 dakika döndürerek tekrar yıkayın.
10. Lekeyi bir hibridizasyon kapağının içine yerleştirin, fazla tamponu çıkarın ve kapatın.
11. Gece boyunca bir kasetin içinde radyasyon içermeyen fosforlu bir görüntüleyici ekranına maruz bırakın.
12. Bir biyomoleküler görüntüleyici kullanarak hibridizasyon sinyalini tespit edin ve uygun yazılımı kullanarak sonuçları analiz edin.

Tablo 1: Tarifler Tablosu

Tampon ve çözelti	yemek tarifi	Yorum
10 X TBE	0.89M Tris tamponu	pH, asetik asit kullanılarak 8.2’ye ayarlanmalıdır
	0.89M Borik asit
	30 milyon EDTA
Jel karışımı	%15 akrilamid-bisakrilamid sol, 19:1	Jel karışımı üre kristalleri içermemelidir
	8M üre
	1 KAT TBE
Jel yükleme boyası	0.05 %(a/h) Bromofenol Mavisi	Deiyonize formamid ile çalışırken dikkatli olunmalıdır
	0.05% (a/h) Ksilen ksiyanol
	% 100 deiyonize – formamid
Probun etiketlenmesi	PNK tamponu (10X, 2 μL)	Bu karışım radyoaktif moleküller içerir, bu adım bir radyoaktif laboratuvarında eğitimli personel tarafından gerçekleştirilmelidir.
	PNK enzimi (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0.1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Yıkama Tamponu – I	2 kat SSC
	%0,5 (a/h) SDS
Yıkama Tamponu – II	0,5 kat SSC
	%0,5 (a/h) SDS
Sıyırma Tamponu – I	0,5 kat SSC
	%0,1 (a/h) SDS
Sıyırma Tamponu – II	0.1X SSC
	%0,1 (a/h) SDS

Materials

40% Acrylamide-bisacrylamide solution 	Sigma 	A9926	Chemical
Ammonium persulphate (APS)	BioRad	1610700	Chemical
Blotting paper	Whatman blotting paper I	1001-125	Assay
Bromophenol blue	Sigma	B5525-5G	Chemical
Capillary loading tips	BioRad	2239915	Plastic ware
Deionized formamide	Ambion	AM9342	Chemical
Heating block 	Eppendorf	5350	Device
Hybond N+nylon membrane	GE	RPN203B	Assay
Hybridization bottle	Sigma	Z374792-1EA	Plastic ware
Hybridization Oven	Thermo Scientific	1211V79	Device
N,N,N',N'- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml	Chemical
PhosphorImager	GE- Typhoon scanner	29187194	Device
PhosphorImager screen and cassette	GE healthcare	GE28-9564-75	Device
Pipettes	Gilson, models: P20 and P10	FA10002M, FA10003M	Plastic ware
Plastic pipette	Falcon	357550	Plastic ware
Polyacrylamide gel apparatus	BioRad	1658003EDU	Device
Sephadex G-25 column	GE healthcare	27532501	Device
Speed Vac Concentrator	Thermo Scientific	20-548-130	Device
Spinwin	Tarsons	1010	Device
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S	Assay
Transblot apparatus	BioRad	1703946	Device
ULTRAHyb hybridization buffer	Ambion	AM8670	Assay
Urea	Fischer Scientific	15985	Chemical
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L	Device
Vortex	Tarsons	3020	Device
Water bath	NEOLAB	D-8810	Device
Xylene cyanol	Sigma	X4126-10G	Assay