Fare beynindeki insan nöral progenitör hücrelerinin nakli

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Transplantasyon prosedürü

1. Ameliyat için hazırlık
   1. Ameliyat ekipmanını temizleyin ve sterilize edin.
   2. Stereotaksik cihazı ve mikroenjeksiyon pompa sistemini hazırlayın.
      NOT: Başlamadan önce Hamilton şırıngasını ve 30 G, 2 inçlik iğneyi test etmek çok önemlidir. İğneyi steril% 0.9 NaCl (sodyum klorür) içeren bir tüpe sokun ve çözeltiyi yavaşça içeri ve dışarı çekin.
   3. Anestezi makinesini kurun. Herhangi bir hayvanı dahil etmeden önce makineyi test edin. İndüksiyon odasını %70 etanol ile temizleyin.
2. Hayvanların hazırlanması
   1. Fareleri alıştırmak için deneylerden en az 7 gün önce standart koşullarda tutun.
      NOT: Bu protokol için aşağıdaki hayvanlar kullanıldı: dişi NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, NSG olarak da bilinir) ve dişi C57BL/6J (20-25 g, B6 olarak da bilinir). İşlem erkek farelerle de yapılabilir.
   2. Farenin vücut ağırlığını ölçün ve enjekte edilecek ağrı kesicinin dozunu ayarlayın. Ağrıyı azaltmak ve / veya enflamatuar yanıtı önlemek için intraperitoneal olarak carprofen (5 mg / kg vücut ağırlığı) uygulayın.
   3. Oksijende buharlaştırılan izofluran (indüksiyon fazında %3 ve ameliyat sırasında idame fazında %1.5-2) kullanarak hayvanları uyuşturun.
      NOT: Cerrahi işlem sonrası hızlı bir şekilde uyanılması ve anestezik gaz seviyelerinin kolayca ayarlanabilmesi nedeniyle gazlı anestezi tercih edilir.
   4. Hayvanın derinlemesine anestezi uygulanmasını sağlamak için nosiseptif refleksler kullanın (örneğin, ayak parmaklarını çimdikleme). Derin anesteziye ulaşıldığında, hayvanı indüksiyon odasından stereotaksik çerçeveye taşıyın. Bir yüz maskesi kullanarak anesteziyi koruyun.
      NOT: Nefes hızının işlem boyunca görsel olarak izlenmesi gerekir (dakikada 40-60 nefes). İşlem sırasında hipotermiyi önlemek için bir ısıtma pedi kullanın.
   5. Gözlerin kurumasını önlemek için oftalmik kayganlaştırıcı uygulayın.
   6. Farenin kafa derisini elektrikli bir tıraş bıçağıyla tıraş edin ve pamuklu çubuklar kullanarak cildi% 5 betadin solüsyonu ile dezenfekte edin.
   7. Fare kafasını sabitleyin ve kulak çubuklarını harici meatus.
      NOT: Kulak zarlarına zarar vermemeye dikkat edin. Kulak çubuklarını takmadan önce her iki kulak kanalına lidokain merhem sürün. Hayvanın kafasının sabit bir pozisyonda olup olmadığını kontrol etmek için, hareket olup olmadığını görmek için kafasını dikkatlice aşağı doğru bastırın. Hareket fark edilirse, kulak çubuğu, burunluk yerleşimi veya her ikisi de yanlıştır ve yeniden ayarlanması gerekir.
3. Kraniotomi
   Orta
   1. hat boyunca lambda ve bregma yer işaretlerini ortaya çıkaracak kadar büyük bir kesim yapmak için cerrahi bir bıçak kullanın.
      NOT: Kafatasını açıkta tutmak için deri ekartörleri uygulanabilir.
   2. Periosteum ve fasyayı bir neşter ile geri çekin ve kafatası yüzeyini kurutmak için steril pamuklu çubuklar kullanın.
   3. Baş pozisyonunu standartlaştırmak için kulak ve ağız çubuklarını ayarlayın.
      NOT: Bregma ve lambda için dikey koordinatların ön-arka konumlandırma için aynı olması gerekir.
   4. İğneyi bregmaya yerleştirin ve istenen enjeksiyon noktalarının koordinatlarını hesaplayın (bu protokol için seçilen ilgilenilen koordinatlar: ön-arka (AP): + 0.5 mm, medial-lateral (ML): + 1.5 mm). İğneyi o noktaya getirin ve mürekkeple işaretleyin.
      NOT: Koordinatlar, Franklin ve Paxinos Fare Beyni Atlası'na göre seçilmiştir. Mesafeler bregmadan mm'dir.
   5. Kafatasına steril% 0.9 NaCl uygulayın ve cerrahi, diş matkabı ile kafatasından 2-3 mm çapında bir delik açın.
   6. İğneyi dura yüzeyine hareket ettirin ve derinlik koordinatlarını hesaplayın.
4. Transplantasyon prosedürü
   1. Viral transdüksiyonlu insan nöral progenitör hücrelerini tüpte yeniden süspanse edin ve 2 μL hücre süspansiyonunu bir şırıngaya (5 μL veya 10 μL) çekin.
      NOT: Hücre süspansiyonunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Hücre sedimantasyonunu önlemek için şırınganın stereotaktik cihaza monte edilene kadar yatay konumda tutulması gerekir.
   2. Şırıngayı hedef bölgenin üzerine yerleştirin (hesaplanan koordinatlar: AP: + 0.5 mm, ML: + 1.5 mm) ve iğneyi yavaşça dura.
      NOT: Doğru koordinatlardan emin değilseniz, hücreleri nakletmeden önce bir boya ile enjeksiyonlar yapın ve enjeksiyon bölgesinin histolojik değerlendirmesini yapın.
   3. İğneyi beyne 0,02 mm/sn hızında uygun derinliğe kadar yönlendirin (bu protokol için seçilen koordinat dorsal-ventral (DV) - 0,8 mm'dir). Derinliği 0,1 mm aşın ve enjekte edilen hücreler için bir cep oluşturmak için iğneyi aynı mesafeden çekin.
   4. Hücrelerin sızmasını önlemek için forseps kullanarak iğnenin etrafına doku yapıştırıcısı sürün.
   5. Hazırlanan hücre süspansiyonunun 2 μL'sini 3-5 nL / s.
      sabit bir oranda enjekte edin: NOT: Enjeksiyon prosedürü 7 ila 12 dakika sürecektir.
   6. Enjeksiyonu takiben, yavaşça çekmeden önce iğneyi en az 5 dakika yerinde bırakın. Kafatasındaki deliği kapatmak için doku yapıştırıcısı uygulayın ve 2 dakika daha bekleyin.