Dorsal Kök Ganglion Eksplant ve Disizosiyasyon Hücre Kültürü Oluşturulması

1. Yetişkin Fareden DRG eksplant kültürü

1. Toplanan DRG'yi 3 mL buz gibi soğuk serumsuz ortam (SFM) içeren 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
2. Her bir DRG'yi kuru bir cam Petri kabına aktarın ve cerrahi mikroskop altında, bir bıçak kullanarak DRG'ye hala bağlı olan fazla lifleri ve bağ dokusunu temizleyin ve kesin. DRG, beyaz spinal sinir/kök boyunca şişkin şeffaf bir yapı olarak kolayca tanımlanabilir. Kan damarları genellikle DRG'yi çevreler.
3. Temizlenmiş DRG'yi buz gibi SFM ortamı içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.
4. Jelatinli protein karışımını (Malzeme Tablosuna bakın) buz gibi SFM'de (1:1) seyreltin.
5. DRG ex vivo'yu 10/20 μL jelatinimsi protein karışımı ile önceden kaplanmış 12 oyuklu plakalarda plakalayın ve 30-60 dakika boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübatörün içine koyun.
6. Tüm eksplantı kaplamak ve eksplantları kültür koşullarında (37 °C ve %5 CO2) korumak için kültür sistemine nazikçe 1,5-2 mL SFM ekleyin.
   not: Bu kritik bir adımdır, çünkü DRG cam tabaklara sadece polimerize jelatinimsi protein karışımı ile sabitlenir. Polimerizasyon süresi ve pipetleme becerileri, yüzmeyi önlemek için kritik öneme sahiptir.
7. DRG'nin yetiştirme ortamını her 72 saatte bir değiştirin ve DRG'nin gerektiği kadar büyümesine izin verin.

2. Tek Hücreli Nöronların DRG'den İzole Edilmesi

1. Toplanan tüm DRG'yi 1.25 mg / mL kollajenaz IV içeren 1.2 mL F12 ortamı ile 1.5 mL steril bir tüpe yerleştirin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 45 dakika inkübe edin. İlk inkübasyondan sonra bu adımı 45 dakika daha tekrarlayın.
2. Eksplantları, 37 ° C ve% 5 CO2'de kollajenaz IV işleminden hemen sonra 30 dakika boyunca tripsin (% 0.025) içeren 2 mL F12 ortamı ile tedavi edin.
3. 37 ° C'de fetal sığır serumu (FBS;% 33) ve% 5 CO2 içeren 2 mL F12 ortamı ile 15 dakika inkübe edin.
4. Eksplantları 2 mL F12 besiyeri ile üç kez yıkayın ve besiyeri bulanıklaşana kadar bir cam pipetle mekanik olarak ayırmaya devam edin.
   not: Bu prosedür, önceki bölümde açıklandığı gibi hayvandan temiz/kesilmiş DRG'nin toplanmasını içerir. Eksplantların mekanik ayrışmasını gerçekleştirirken, nazik olun ve aşırı güç kullanmayın, çünkü bu, dökülmeye ve çalışma malzemesinin kaybına neden olabilir.
5. Herhangi bir safsızlığı ve fazla bağ dokusunu gidermek için ayrışmış hücre kültürünü 0.22 μm'lik bir filtreden süzün. Filtrelenmiş hücre lizatını (2.500 x g) sıcaklıkta 2 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini nöronal kültür (1x), antibiyotik karışımı (1x), L-glutamat (0.5 mM) ve sinir büyüme faktörü (5 μg/mL) için takviye içeren 500 μL nörobazal ortamda yeniden süspanse edin (bkz.
7. Ayrışmış hücreleri, tercih edilen hücre yoğunluğunda laminin kaplı örtü slaytlarına (50 μg / mL; Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin. Bir hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu belirleyin.
   not: Hücreleri 25.000 hücre / kapak slaytında kapladık. Bu teknik, hem nöronların hem de glial uydu hücrelerinin ayrışmasına izin verir. Psödounipolar nöronlarla birlikte kültürlenen glial bileşen, nöronal sağkalımda kritik bir rol oynar.