Pestisitlerin Caenorhabditis elegans Nöronları Üzerindeki Etkisinin İncelenmesi

1. Pestisit kaplı Petri plakalarının hazırlanması

1. Standart prosedürleri kullanarak agar Petri kapları (6 cm çap en iyi sonucu verir) hazırlayın.
   not: Bunlar aylar öncesinden yapılabilir ve kullanılana kadar buzdolabında saklanabilir. Tabakları tezgah üzerinde oda sıcaklığına (RT) getirin. Çoğu durumda, öğrenci gruplarına, su kontrolü de dahil olmak üzere, pestisit karışımının her seyreltilmesi için bir plaka sağlanmalıdır.
2. Seçilen pestisitin her seyreltilmesinden 1.5 mL etiketli 1.5 mL mikrofüj tüplerinde hazırlayın. Güvenli kullanım için, talimatları okuduğunuzdan ve eldiven sağladığınızdan veya öneriliyorsa çeker ocakta çalıştığınızdan emin olun.
   not: Test etmek için önerilen seyreltmeler: 1 mL tam güçlü pestisit, suda 1:10 seyreltme (100 μL pestisit, 900 μL damıtılmış su), 1:100 seyreltme (10 μL pestisit, 990 μL su), 1:1000 seyreltme (10 μL 1:10 seyreltme, 990 μL su), vb.
3. Bir cam Pasteur pipetini (9 ml boyutunda) bir Bunsen brülör alevinde dikkatlice bükerek bir çözelti yayıcı yapın. Pipetin açıklığını kapatmak için alevi kullanın. Ardından, Petri plakasına her yayılmadan önce yayıcıyı etanol ile sterilize edin.
4. Bir mikropipet kullanarak, 100 μL seyreltmeyi (veya su kontrolünü) agarın ortasına yerleştirin ve sterilize edilmiş yayıcı ile yüzeye nazikçe yayın. Her kullanımdan önce yayıcıyı yeniden sterilize edin.
5. Üstü kapalı Petri kaplarını bir kenara koyun ve solüsyonun "kuruyana" kadar yüzeye çıkmasına izin verin.
   not: Laboratuvardaki pestisit ve nem seviyelerine bağlı olarak bu biraz zaman alabilir. Öğrencilerin tabaklarını maruz kalma süresinden bir gün önce hazırlamaları gerekebilir.
6. 12 saatten daha uzun maruz kalma süreleri için, nematodları eklemeden önce plakalara gece boyunca 50 μL Escherichia coli kültürü ekleyin. Akut deneyler için (12 saat veya daha az), plakalarda E. coli olmasına gerek yoktur.

2. Pestisit kaplı plakalara nematod eklenmesi

>NOT: Öğrencilerin, Caenorhabditis elegans Genetik Merkezi'nden temin edilebilen floresan suş LX929'dan bir tabak yetişkin nematoda (5 günlük kültürler en iyisidir) bulundurmaları gerekecektir. Bunun için iki olası prosedür vardır. Öğrenciler nematodlarla çalışma konusunda daha önce deneyime sahipse (örneğin, bu prosedür çok haftalık bir alıştırmanın parçasıysa ve nematodları bir solucan penası ile nasıl toplayacaklarını zaten öğrenmişlerse), Adım 2.1'i kullanın. Eğer yapmadılarsa, Adım 2.2'yi kullanın.

1. Bir solucan penası ile nematodları toplayın. Bir Bunsen brülör alevi kullanılarak bir Pasteur pipetine eritilen 1 inçlik bir platin tel parçasından bir solucan penası oluşturun. Kazmanın üzerine küçük bir yapışkan E. coli damlası alın ve ardından yapışkan lekeyi kullanarak yetişkin nematodları alın. İyi bir numune boyutu için, her tedavi plakası için 10 nematod seçin.
   not: Çok fazla deneyimi olmayan öğrenciler Adım 2.2-2.3'ü takip edebilirler.
2. Nematod plakasına 1 mL steril su koymak için bir mikropipet kullanın. Nematodları kaldırmak için suyu çalkalayın, ardından nematodlarla birlikte sıvıyı 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne alın.
3. Nematodların yerçekimi ile yaklaşık 10 dakika çökmesine izin verin, ardından en az 500 μL suyu dikkatlice çıkarın ve atın. Nematodları yeniden süspanse edin ve kesilmiş sarı bir pipet ucu kullanarak, her bir tedavi plakasına 50-100 μL asılı solucan çıkarın. Her plakada en az 10 yetişkin solucan olduğundan emin olun.
4. Bir zamanlayıcı ayarlayın veya zamanı not edin ve seçilen süre boyunca nematodları RT'de maruz bırakın. Seçilen maruz kalma süresi boyunca, ıslak montajlar için mikroskop slaytları hazırlayın. Slaytlar mikroskopi ile aynı gün yapılmalıdır.
   not: Öğrenci grupları, bağımsız çalışmaları için planlama sırasında maruz kalma zamanlarını seçmiş olacaklardır.

>3. Islak montajlar için mikroskop slaytlarının hazırlanması

NOT: Adım 3.1-3.3 her öğrenci grubu tarafından gerçekleştirilebilir. Her biri üç slayt hazırlayın.

1. Slaytın yalnızca bir tarafına bir parça etiket bandı yerleştirerek iki slayt hazırlayın. Bant, agarozun düzgün kalınlıkta bir ped oluşturması için doğru kalınlığı oluşturmak için kullanılır. Ardından, şekilde gösterildiği gibi, aralarına temiz, kullanılmayan bir sürgüyü tezgah üzerine yerleştirin.
2. Ortadaki sürgünün ortasına 10 μL'lik bir damla erimiş agaroz (çift damıtılmış suda (ddH₂O) %3, 65 °C kuru blok ısıtıcı kullanılarak ısıtılır) yerleştirmek için bir mikropipet kullanın.
3. Şekilde gösterildiği gibi, damlanın bulunduğu slayta dik olarak üstüne başka bir temiz slayt yerleştirerek damlayı düzleştirin. Basınç uygulayarak düzleştirin, böylece agaroz damlası etiketleme bandının kalınlığını oluşturur.
4. Agaroz yaklaşık 1 dakika içinde katılaşacaktır. Ardından, iki sürgüyü ayırmak için sabit bir basınç uygulayın. Agar çemberi slaytlardan birine yapışacaktır. Bu kaydırağı agar tarafı yukarı bakacak şekilde tezgahın üzerine koyun ve kullanmadan önce 1-2 dakika kurumasını bekleyin.

4. Canlı nematodların mikroskop slaytlarına montajı

1. Agaroz pedi ile hazırlanan slayta nematod eklemek için, agar pedine 1 M sodyum azid (_NaN3) içeren 5 μL'lik bir damla su ekleyin. Bu çözelti solucanları uyuşturur ve onları hareketsiz hale getirir.
   Dikkat: Sodyum azid stok çözeltisi yutulduğunda hastalığa neden olabilir.
2. Daha sonra nematodları (tedavi slaytı başına en az 10 tane) bir solucan penası kullanarak damlacığa aktarın. Nematodları aktarmak için kazmayı kullanmadan önce ve sonra sterilize edin.
3. Bir lamel eklemek için forseps kullanın, onu bir açıyla yerleştirerek ve yavaşça indirerek. Bir kalem veya metal prob kullanarak lamellerin çok hızlı kaymasını veya alçalmasını önleyin.
4. Solucanları gözlemlemek için hazırlanan ıslak montajı bir floresan mikroskobu üzerine yerleştirin, önce 10x büyütme ve faz kontrastı altında, ardından faz kontrastı ve flüoresan aydınlatma ile 40x büyütme altında.

5. Floresan mikroskobu

>NOT: Öğrenci grupları, uygun şekilde etiketlemeleri gereken ayrı mikroskop slaytlarına her türden birkaç solucanın ıslak montajını yapmalıdır. Aşağıdaki talimatlar, bağlı bir trinoküler kuruluma, dijital kameraya ve bilgisayar sistemine sahip olabilen standart bir floresan bileşik mikroskobunun kullanımı hakkında genel ipuçlarıdır. Öğrenciler, hedefler, ışık filtresi türleri, parlak alan ve floresan ışığı arasında geçiş yapma yeteneği, ışık sinyalinin dijital kameraya nasıl gönderileceği vb. dahil olmak üzere mikroskobun ayarlarına aşina olmalıdır.

1. Mikroskop tablasına her seferinde hazırlanmış bir ıslak montaj parçası yerleştirin ve mikroskop tablası klipslerini kullanarak yerine sabitleyin.
2. Tipik olarak 10x olan en düşük büyütme objektifiyle ilk kez görüntüleyerek ıslak yuvaları görüntülemeye başlayın ve nematodları görselleştirmek ve onlara odaklanmak için parlak alan veya faz kontrastı kullanın.
3. Görüş alanına bir nematod yerleştirildiğinde, mikroskop üzerindeki ince odak düğmesini kullanarak ona odaklanın. Kadranı çevirerek aydınlatmayı floresana geçirin. Ardından dijital görüntüleri yakalamak için ışığı kameraya yönlendirin. Görüntüleme yazılımını kullanarak aydınlatmayı, nöronların parlak bir şekilde aydınlatılacağı ancak aşırı doygun olmayacağı şekilde ayarlayın.
4. Bir noktada, şekilleri için bir büyütme ölçeği sağlamak için hücre görüntüleriyle aynı büyütmede bir cetvelin ayrı bir görüntüsünü elde edin. Saydam bir cetvelin kısa bir bölümünü veya bir mikrometre slaytını mikroskop tablasına yerleştirin, ince odak düğmesini kullanarak üzerine odaklanın ve görüntüleme yazılımını kullanarak bir görüntü elde edin.
5. Mümkünse daha yüksek büyütme oranlarında ek görüntüler (en az 10 ayrı nematoddan) elde edin. Yoğun ışık muhtemelen görüntülendiği alanı ağartacaktır, bu nedenle görüntülemeyi dikkatlice izleyin ve ışığın slaytın aynı alanında uzun süre kalmasına izin vermeyin. Nematod ve bölgenin yanı sıra tedavi ve büyütmeyi takip etmek için elde edilen görüntüleri adlandırdığınızdan emin olun.
6. Bilgisayarda bir klasör oluşturun ve görüntüleri analiz ve şekil hazırlamada kullanmak üzere klasöre taşıyın.

>6. Morfolojik bütünlük değerlendirme ölçeği

NOT: Nöronlardaki nörodejeneratif hasarın önemli bir sitolojik özelliği, soma morfolojisindeki bir değişikliktir. Kolayca görüntülenebilen ve sayılabilen üç morfoloji vardır.

1. Şekil 1 ve 2'de gösterildiği gibi, pürüzsüz, düzgün floresan süreçlere ve yuvarlak olmayan hücre gövdelerine sahip nöronları normal şekilde sayın.
2. Genellikle, soma sağlıklı, genç nöronlarla karşılaştırıldığında yuvarlak ve şiş görünümlü hale gelir. Buna benzeyen nöronları "yuvarlak" olarak sayın.
3. Uzun nöral süreçlere sahip nöronlar, süreçlerde yuvarlatılmış punktaların ve hatta boşlukların olduğu yerlerde kanama sergileyebilir. Bu özellikleri gösteren nöronları "blebbed" olarak sayın.

Şekil 1: Neonikotinoid içeren bir pestisitin nöron morfolojisi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi. (A) Floresan suş LX929'dan tedavi edilmemiş kolinerjik nöronlar. (B) Pestisitlere maruz kalan (T + S) kolinerjik nöronlar. (C) İki durumda kanama sergileyen nöronların yüzdesi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasıdır. tek yönlü bir ANOVA'dan p < 0.001'i gösterir. 12 ayrı nematoddan toplam 113 nöron analiz edildi. Bu rakam Bradford ve ark. (2020).

Şekil 2: Manganez içeren bir pestisitin dopamin nöron morfolojisi üzerindeki etkileri. Öğrenci grubu, figürleri için bir ölçek çubuğu sağlamadı, ancak görüntüyü 40x büyütmede çekti. (A) Kontrol solucanlarında varsayılan CEPDL ve CEPVL nöronal soma (etiketli). Sağlam baş nöron soma ve süreçleri dejenerasyon eksikliğini gösterir. (B) Akut maruz kalan solucanlarda varsayılan CEPD L&R süreçleri (yıldız) ve CEPV L&R nöronal soma (etiketli). Soma ve süreçler GFP'yi ifade etti, ancak dorsal süreçlerde GFP ekspresyonunda bir azalma var gibi görünüyor. (C) Kronik olarak maruz kalan solucanlarda varsayılan CEPDL ve CEPVL nöronal soma (etiketli). Soma, GFP'yi ifade etmedi ve süreçler görünmüyordu, bu da önemli bir dejenerasyona işaret ediyordu.