Yetişkin Drosophila Sineklerinde Penetran Travmatik Beyin Hasarına İndükleme

1. Penetran travmatik beyin hasarı (PTBI; Şekil 1)

1. Yeni kapatılmış F1 sineklerini sıralayın. Eklosiyondan sonraki 6 saat içinde genç erkekleri seçin. Bu erkekleri, şişe başına 40 veya daha az sinek olacak şekilde yiyecek içeren temiz şişelere yerleştirin.
   NOT: Bu, en kolay sabahın ortasında CO₂ pad üzerindeki sinekleri uyuşturarak ve bağırsaklarında hala mekonyum (karın duvarından koyu yeşilimsi bir nokta olarak görülebilir) bulunan yetişkin erkekleri belirleyerek gerçekleştirilir.
2. Minutien pimlerini (bkz. Malzeme Tablosu) %70 etanol ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ~100 pim yerleştirerek en az 5 dakika sterilize edin.
3. CO₂ pedi ve bir boya fırçasını %70 etanol püskürterek sterilize edin ve temiz, tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Aletler temiz ve kuru hale geldikten sonra, 40 veya daha az sıralanmış F1 erkeğini temiz pedin üzerine geri aktarın.
4. F1 erkeklerini sineklik üzerinde 2 gruba ayırın. Bir grup, yaralanmamış sinekler kontrol görevi görecektir. İkinci deney grubu PTBI'ye tabi tutulacaktır.
5. Forseps kullanarak, mikrosantrifüj tüpünden 4-5 yeni Minutien pimi çekin ve bunları CO₂ pedinin kenarına yakın bir yere yerleştirin. Diseksiyon kapsamı altında, keskin uçlu düz bir Minutien pimi seçin.
   NOT: Bir deney için tek bir Minutien pini kullanmak değişkenliği azaltacaktır. Keskin pimleri yeniden kullanın. Hasarlı veya kör pimleri, güvenli bir şekilde imha etmek için %70 etanol içeren ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
6. Standart çaprazdan gelen sineklerle çalışıyorsanız, yeşil floresan proteini (GFP) için uygun uyarma ve emisyon filtreleriyle donatılmış stereo mikroskop ışık yayan diyot (LED) lambasını açın. Bu, 440-460 nM'de uyarılmaya izin verir ve 500-560 nM'lik görselleştirmeye izin verir.
   NOT: Bu lamba ve filtre seti ile mantar gövdesinin hücre gövdeleri kafa kütikülünden yeşil renkte floresan yayılacaktır (Şekil 1C). Perma-ikiz sinekler veya diğer genotiplerin sinekleri için, mantar gövdesindeki yaralanmayı hedeflemek için kafa kütikülü üzerindeki yer işaretlerini görselleştirmek için stereo mikroskop için standart bir beyaz ışık aydınlatıcı kullanılabilir (Şekil 1C).
7. Seçilen Minutien pimini bir elinizle (sağ elini kullananlar için bu genellikle sağ eldir) ve diğer elinizle (genellikle sol) boya fırçasını almak ve tutmak için forsepsleri kullanın. Deney grubundan bir sinek seçin ve sineğin, sineğin başı sağa bakacak şekilde baş kapsülünün sırt görünümüne sahip olacak şekilde konumlandırın. Fırçayı dorsal toraksın ön kısmına yerleştirin ve sineği stabilize etmek için hafifçe aşağı doğru itin.
8. Minutien iğnesinin ucunu başın sağ tarafındaki mantar gövdesinin hücre gövdelerine doğrultun ve kafa kapsülüne nüfuz edin. Yer işaretleri kullanıyorsanız, ocelli ile gözün sırt kenarı arasındaki dorsal baş kütikülünü hedefleyin (Şekil 1).
9. Yaralanmayı tamamladıktan sonra, kafayı Minutien piminden nazikçe itmek için boya fırçasını kullanın.
10. Beyni RNA-Seq veya qRT-PCR için kullanıyorsanız, başın sol tarafında ikinci bir yaralanma yapın.
11. Deney grubundaki tüm sinekleri yaralamak için 2.8-2.10 adımlarını tekrarlayın.
12. Tüm sinekler yaralandıktan sonra, kontrolü ve yaralı sinekleri yiyecek içeren etiketli, ayrı şişelere yerleştirin. Sinekler anesteziden kurtulurken ve sonraki yaşlanma sırasında sineklerin yiyeceğe takılmasını önlemek için şişeleri yatay olarak (yani yanlarına) yerleştirin.
13. Standart çapraz sinekleri 25 °C'de ve perma-twin sinekleri 30 °C'de yaşlandırın.
14. 24 saatten daha eski sinekler için, her 1-2 günde bir temiz yiyeceklere yerleştirin.

Şekil 1: Erişkin Drosophila merkezi beynine Penetran Travmatik Beyin Hasarı (PTBI). (A) Yetişkin bir sinek kafasının dış şeması. Bu önden bir görünümdür. Böylece, hayvanın sağ tarafı izleyicinin solundadır. (B) Yetişkin bir Drosophila kafasının iç kısmının şeması, yaralanma yörüngesi gri ile gösterilmiştir. Bu bir posterior görünümdür. Böylece, bu görüntüde ve sonraki şekillerde, beynin sağ tarafı sağdadır. Merkezi beyin PTBI, mantar gövdesi (yeşil) ve yağ gövdesi (mavi) ve hemositler (kırmızı) dahil olmak üzere beynin dışındaki dokular dahil olmak üzere birçok beyin yapısını etkiler. CB = merkezi beyin bölgesi. OL= optik lob bölgesi. (C) Mantar cisimciklerinin (ok uçları) yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlendiği canlı bir yetişkin kafasının dorsal görünümü. Bu 'standart genotip'tir (ayrıntılar için metne bakın). PTBI protokolü tekrarlanabilir bir şekilde mantar cisimciklerinin yaralanmasına neden olur.