Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila

DOI: 10.3791/51062

November 19, 2013

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Drosophila nedeniyle hızlı bir nesil zaman, düşük deney maliyetinin, genetik ve çevresel faktörlerin manipüle ve kontrol yeteneği nöral devre geliştirme eğitimi için son derece güçlü bir model sistem. Nöron, nöronal yol bulma ve sinaptogenez insan ve Drosophila arasında muhafaza edilir, bu nedenle, oluşturma, bakım ve nöral devreleri değiştirerek mekanizmalar da korunmuştur.

Gibi serotonin (5-hidroksitriptamin veya 5-HT) gibi klasik nörotransmiterler, olgun sinir devresinde ^1-3 sinyal molekülleri olarak rollerini kabul etmeden önce, büyüme faktörleri olarak görev yapabilir Daha önceki çalışmalar, olgun nöronların ^4'ün bağlantı değiştirebilir embriyojenez sırasında 5-HT seviyelerini tedirgin göstermiştir. Diğer Helisoma kültürlü nöronlar için 5-HT ektopik uygulama nörit gelişimini hem de sinaptogenez ^5-7 baskı altında olduğunu göstermiştir. D'derosophila, gelişimsel 5-HT seviyeleri ters olarak CNS ⁸ foregut için çıkıntı nörit uzunluğu boyunca varis sayısı ve boyutu, hem de aborization derecesi ile ilgilidir.

Serotonerjik sinir Drosophila ^8-9 de dahil olmak üzere, çeşitli türlerde beslenme davranışları modüle ettiği gösterilmiştir. Drosophila besleme devresi foregut beyinden aksonal çıkıntıların gelişiminde değişiklikler ile fonksiyonel çıkış (besleme) ilişkilendirmek için bir model olarak kullanılabilir nispeten basit bir devredir. Schoofs et al. Drosophila larva besleme kasları ¹⁰ etkileyebilir merkezi desen jeneratörleri tarafından düzenlenir olduğunu göstermiştir. Spesifik kas anatomi tam olarak anlaşılamamakla birlikte, bu antennal sinir, üst çene siniri ve protorasik bezle aksesuar sinir katılan kas hedefler için sorumlu olduğu gösterilmiştirbeslenme davranışı. Omurgasız besleme kas ve sinir anatomisi ile ilgili en veri Calliphora larvaları ile sınırlıdır.

İkinci instar larvalarının besleme oranı cephalopharyngeal sklerit (ağız kancalar) geri çekilmesi ile değerlendirilmiş ve tekrarlanabilir ve yüksek verimli edilebilir. Cephalopharyngeal plakaları frontal sinir yoluyla santral 5-HT nöronların lifleri tarafından innerve edilir. Proventrikülüs veya foregut, midgut salkımlı ve (Şekil 1) ^11-12 foregut kasılmaları sorumludur serotonerjik lifler (sinir nüks) tarafından innerve edilir. Aksonal dallanma değişiklikler ve nörit uzunluğu boyunca varikositlerden sayısı ve büyüklüğü, immünohistokimyasal teknikler kullanılarak kantifiye edilebilir. Ya doğrudan ya da dolaylı olarak, geliştirme sırasında nöronal 5-HT idare etme şekillendirmeler değişiklikler ile değerlendirilir ve korele edilebilir, bu besleme devresinin fonksiyonel çıkışı değiştirebilirnörit mimari gy.

1.. Nüfus Kafes Bakım

1. 12 saat ışık-karanlık çevrimi ile 25 ° C 'de nüfus kafesleri koruyun. Sürece kontrol ve deney grupları aynı aydınlatma koşullarına maruz kaldığı zaman, bu teknik, standart bir laboratuvar ortamında gerçekleştirilebilir.
2. Kadın elma suyu agar plakaları üzerinde gece yumurtalarını bırakmak için izin verir.
3. 24 saat boyunca 25 ° C 'de, yeni biriken yumurta plakaları koruyarak yeni yumurtadan çıkmış larva toplayın. Taranmış larva çekmek için plakanın ortasına maya küçük topak yerleştirin.
4. Elma suyu plakasının merkezinde maya hamur içine göç ^1. instar larvaları toplamak. Taze elma suyu plaka aktarmak için metal bir spatula kullanın. Ek maya hamur tahliller yapılana kadar yeterli gıda olmadığından emin olmak için ilave edilebilir. Üzüm suyu plakaları da elma suyu levhaların yerine kullanılabilir.
5. Geç ^2.-erken 3 ^instar l elde^1. 40-48 saat için yaş Instars izin vererek arvae. Bu aralıkta yemleme ¹³ sabittir. Her larva molt bu yapıda belirgin değişiklikler olduğu gibi yaş ağız kanca incelenmesi ile teyit edilebilir.
6. ^2. geç-erken 3. ^instar larvaları yavaşça ve yaygın su ile elma suyu tabak yıkama ve bir gözenekli filtre üzerine toplanmasıyla larvaları davranış testleri için toplanır. Larvalar daha sonra bir agar plakası üzerine aktarılır.
7. Tüm analizler kontrol ve deney hayvanları kullanarak paralel olarak gerçekleştirilir.

2. Davranış Paradigma - Locomotion

1. Bir 100 mm doku kültürü çanağı içinde bir% 2 agar tabaka üzerinde tek bir ^3. deri değiştirme safhasında larva yerleştirin ve larva 30 saniye süre ile uyum sağlamaya izin verir. Larva agar alt-tabakanın yüzeyi üzerinde vücutlarını itmek için cephalopharyngeal sklerit (ağız kanca) kullanın. Bu ayrı bir tabakta yapılır çünkü it hayvan neredeyse maya gibi aynı renkte olduğu gibi maya çözelti içinde vücut kasılmaları görselleştirmek için daha zordur.
2. 1 dakikalık bir süre için alt-tabaka üzerinde ön hareketine her posterior dikkat edin ve kaydedin. n = her bir genotip için 20. En fazla 10 hayvan plaka başına test edilmelidir.

3. Davranış Paradigma - Yemleme

1. Küt paslanmaz çelik 5. cımbız kullanarak dikkatli bir şekilde% 2 aktif ekmek mayası çözeltisi, 5 ml ile kaplanmış bir agar dolu plakasının merkezine lokomotor agar plakasından 3. ^instar larvası aktarın. Maya zamanla razı olacak gibi çözüm homojen olduğundan emin olun. Ne maya çözeltisi içinde büyük ölçüde larva davranış gözlem kolaylaştırmak, yer ve yem kalacaktır. Ağız kanca kasılmaların hızı, doğrudan ¹⁴ yutulur gıda miktarı ile ilişkilidir.
2. Larva 30 saniye gelmesini bekleyin.
3. Gözlemlemek ve sayısını kaydetmek1 dakikalık bir süre boyunca ağız kanca kasılmalar. n = her bir genotip için 20.

4. Larva Gut Diseksiyonlarında

1. 3-çukurlu nokta cam 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) ve yerinde bir% 4 EM dereceli formaldehit tespit çözüm olun.
2. Dikkatle, 1x PBS solüsyonu kullanarak 3-iyi bir cam tabak geç 3 ^instar larva cesareti dolaşıp proventrikülüs değişmeden kalır emin her zaman yapmak teşrih. Bir forcep ile, posterior ucundan tutun ve diğer, ağız kanca tutun. Posterior uç hareketsiz tutarken, hafifçe cesareti erişmek için ağız kanca çekin. Ilişkili herhangi bir doku (tükrük bezleri, beyin, vücut yağ, vb) çıkarın, daha sonra formaldehit düzeltmeyi içeren 3-iyi bir çanak her gut aktarın. 3. ^instar larva dolaşıp çünkü gelişme bu aşamada, larva pupariation için hazırlık beslenme ateşkes kullanılan ve proventrikülüs maya temizlenir.
<li> opak bir doku kültür kutusuna bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin bağırsaklar.
3. Kuyulardan formaldehit tespitine çözüm çıkarmadan önce, mide çekumlardan kaldırmak ve projeksiyonlar açıkça engel olmadan görülebilir böylece proventriculus gelen ~ 150 mikron ² midgut klibi.
4. Kuyulardan formaldehit düzeltme çıkarın ve 1x PBT (1 x PBS,% 0.1 'lik bir proteaz içermeyen sığır serumu albümini,% 0.1 Triton X-100) tampon çözeltisi ile değiştirin. İyice 1x PBT 10 dakika boyunca cesaretin 6x yıkayın. Yıkar yaparken mekanik bir döndürücüde doku örnekleri yerleştirin.
5. 10 ^-6 M serotonin sinyalini geliştirmek için 5-HT 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin. İyice 1x PBT 10 dakika boyunca cesaretin 6x yıkayın. Önceki çalışmalar eksojen 5-HT bu konsantrasyon immünohistokimyasal analizler nöronal mimari veya varis yoğunluğunu etkilemez gösterdi ve sadece gürültü ^{oranı, 15-16} sinyal artırır var.
6. 4 inkübe &# 176; C gecede, anti-serotonin primer antikor (fare ya da tavşan poliklonal büyüdü monoklonal) içinde. İyice 1x PBT 10 dakika boyunca cesaretin 6x yıkayın. Yıkar yaparken mekanik bir döndürücüde doku örnekleri yerleştirin.
7. (; 1:400 seyreltme Alexa Fluor 568 keçi anti-fare ya da anti-tavşan IgG), ikincil antikor olarak, 90 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. İyice 1x PBT 10 dakika boyunca cesaretin 6x yıkayın. Yıkar yaparken mekanik bir döndürücüde doku örnekleri yerleştirin.
8. Mekanik bir karıştırıcı üzerine, 10 dakika boyunca 4 mM sodyum karbonat içinde inkübe, daha sonra n-propil gallate/20 mM sodyum karbonat% 4 montaj ve floresan altında görünüşüdür. Sodyum karbonat mountant ortam içinde kullanılan tampon ve pH örnekleri dönüştürmek için kullanılır.
9. Analizi için 400X büyütme ile immunohistokimyasal doku örneklerinin görüntüler yakalayın.

5. Sinir Devre Analizi

1. Nörit lifler (nicelleştirilmiştir sayısı ve büyüklüğü varikositlerdenve dallanma derecesi) Neuroleucida ve Neuroexplorer kullanarak. Ancak, bu da elle gerçekleştirilir veya Basit Neurite Tracer (online indirilebilir ücretsiz bir uygulama) kullanılarak yapılabilir.
2. Proventriculus beyinden gelen tek lif projeksiyonları Trace ve varis numarası, şube ve birim uzunluk başına büyük varisler sayısını ölçmek. Beyinden çıkıntı aksonal lifler nüks sinir bindirildiğini ve onlar onlar ayrı proventrikulus ve salkımlı ulaşana kadar analiz için erişilebilir değillerdir.

Drosophila larva serotonerjik besleme devresi sinir sistemi gelişiminde belirli faktörlerin etkisini gözlemlemek için son derece etkili bir model olarak hizmet edebilir. Besleme hızı ile ölçülmesi, bu fonksiyonel çıkış (Şekil 1) ile birlikte besleme devresinin aksonal mimarisi bağlamak mümkündür. Larvalar agar yüzeyi boyunca kendilerini itmek için ağız kanca kullandığından lokomotor deney, ağız kancaların geri çekme için fizyolojik bir kontrol olarak kullanılır. Mutasyonlar besleme devresi 8 (Şekil 2A) etkiler, ve kontrol mutant genotipler arasında lokomotor yanıtları arasında hiçbir fark yoktur olmalıdır. Önemli farklılıklar ortaya yaparsanız, bu larva davranış yanlış kullanım tatlıya mümkündür. Tahlil sırasında larva durdurma ağar tabaka boyunca yuva teşebbüs etmek, onlar çok eski olabilir ve muhtemelen Instars dolaşıp geçiş vardır.Bu agar tabaka zor larva ağız kanca agar tabakayı kapmak için yapım nedenle, çok zor olabilir de mümkündür, bu agar yüzeyini ıslatma tarafından ele alınabilir.

Bu deney, nöronal anatomik kusurları ile Drosophila suşları serotonerjik besleme devresinin gelişimini etkileyen olup olmadığını değerlendirmek için kullanılabilir. Açık olan mutant elipsoid gövdesi (EBO 3) merkezi kompleksinin elipsoid gövdesi içinde bir yapısal kusur vardır. Yabani tip ebeveyn Canton-S suşu, CS Wu ile karşılaştırması, bu anatomik depresif bozukluklar beslenmesinde beyin gelişimi süresince sonucunda hareket (Şekil 2B) etkilenmez iken ortaya koymaktadır.

3 mutantları bağırsak nörit gelişimini mimarisinin değiştirmek için görünen Ebo olarak anatomik kusurları. Şekil 3 EBO 3 larvaları iştigal fiber mimarisinde değişiklikleri gösterirCS wu kırmızı, bu larvalar dallanma bir artış hem de nörit uzunluğu boyunca küçük ve büyük varikositlerden sayısında bir artış gösterir. Dal düğümleri (oklar) dikkat, (ok uçları), ve büyük varisler (yıldız) varisler. Şekil 4 bu görüntülerin kantitatif temsil eder.

Aksonal mimari doğru kantitasyonu ve görüntüler. Şekil 5A analizi için uygun olan bir görüntüyü temsil eden son derece açık olması gerekir. Düşük kalite Görüntüleri zor lif ve varisler (Şekil 5B) ayırt yapacaktır. Lif mimari çekimlerde, lifler sıkıca paketlenmiş olan ve birbirinden ayıran ve onlar dallı gibi görünebilir beri proventriculus ve anterior projeksiyonlar dahil görüntüleri alarak kaçının. Onlar salkımlı çünkü midgut içinde daha posterior lifler daha dallı kez bir Bu doku içinde yeniden. Dal ve varis sayısı ve büyüklüğü varikositlerden kantitasyonu, el ile ya da Neuroleucida gibi nörit morfolojisi, okuyan amacıyla tasarlanmış bir program ile analiz edilebilir. Sürece proventrikülüs immünohistokimyasal protokol sırasında hasar ve görüntü odakta olduğu değil gibi, hazırlıklar görüntüleme ve analiz için kabul edilebilir olacaktır. Fiber mimari açıkça arka plan ayırt edilebilir, ve ayrı ayrı varisler nörit uzunluğu boyunca tespit edilebilir ise, preparasyon analizi için uygun değilse. Bireysel varisler lifin geri kalan kısmına tespit edilebilir, ayrıca, bu da analiz için kaliteli bir görüntünün başka bir göstergesidir. Tüm bu lifler hariç olmak üzere analiz edilmiştir odak noktası aralığında (odak birden çok sayıda düzlemde arasında bazı durumlarda lifler olacaktır eğri) üzerinden.

es/ftp_upload/51062/51062fig1.jpg "width =" 500px "/>
Şekil 1. Larva besleme devresi. Beyin ve bağırsak dokuları (A) gösteren, 3. instar larvası bir fileto. 3. instar larvaları kesilerek Gut dokuları Drosophila nöronal triptofan hidroksilaz karşı ortaya çıkan bir antikor ile immün boyanmış olan (DTRH, B) ya da 5-HT ( C). A, B. E, yemek borusu, Mh, ağız kanca, Pr, proventriculus, Br, beyin (5-HT nöronlarının desen dikkat edin). Ok frontal sinir gösterir;., Nüks sinir C ok. proventrikülüs aksonal lifler (ok başları) gösteren. Ölçek çubuğu = 20 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

<br /> Şekil 2. Depresyonda beslenme davranışı beyin geliştirme sonuçlarının sırasında anatomik bozukluklar. Hayvanların lokomotor (A) ve beslenme davranışları (B) için tahlil edildi. Locomotion etkilenmedi. n = 2-3 bağımsız deneyin her davranışsal deney için 20,. **** P <0.0001, t-test. Grafiğin yukarısındaki Hatları ortalamanın standart hatası betimliyor. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,. Gut fiber mimaride sapmaları olarak CNS sonuçları 3. instar larvaları kesilerek ve anti-5-HT ile boyanmış. Gut doku gelişimi sırasında anatomik kusurları. Ok şube düğümünü gösterir. Ok ucu küçük bir varis gösterir. Asterisk deBüyük varisler belirtiyor. Ölçek çubuğu = 40 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. Anormal bağırsak fiber mimarisi kesilmiş ve anti-5-HT ile kuluçkalanır 3. instar larvaları proventricular doku. Analizi sonucu olarak beyin gelişimi sırasında anatomik kusurları. 0.1 mm nörit uzunluğunun (B) ve büyük varisler sayısı başına toplam varisler, nörit (A) dallanma, sayısı (> 1 Pm'lik 2) 0.1 mm uzunluğu (C) başına. CS wu, 2 bağımsız deneyden 17 bağırsaklar 20 elyaflar; Ebo 3, 3 bağımsız deneyden 18 bağırsaklar 20 elyaf. **** P <0.0001, ** p <0.01, * p <0.05, tt eşleşmemişGrafiğin üstündeki verileri Hatları ortalamanın standart hatası betimliyor. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. Görüntülerin kalitesi gut fiber mimari uygun miktar tayini için önemlidir. CS wu 3 instar larvaları kesilerek ve anti-5-HT ile boyanmış Gut dokuların. (A). Iyi kalitede görüntü. (B). Kötü kaliteli görüntü. Ölçek çubuğu = 40 mikron. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Biz ifşa hiçbir şey yok.