Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

Yaralı MSS aksonlar rejenere ve genellikle uzak yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. İlk yaralanma kurtulmuş aksonlar sonra ikincil aksonal dejenerasyonu uğrayabilir. Spinal kord içindeki büyüme konisinin oluşumu, rejenerasyon ve ek miyelinli akson projeksiyonlar kaybı olmaması büyük ölçüde yaralanma sonrası nörolojik iyileşme sınırlar. Omuriliğin miyelinli aksonları yaralanma nasıl tepki merkezi değerlendirmek için, biz kaderi belgelemek için sarı floresan akson protein ve fokal ve yüksek tekrarlanabilir lazer kaynaklı omurilik yaralanması ifade transgenik fareler kullanan omurilik modeli yaşayan bir ex vivo geliştirdi İki foton uyarma time-lapse mikroskopi kullanılarak akson ve zamanla miyelin (lipofilik floresan boya Nil Kırmızı). Akut aksonal yaralanma, akson retraksiyon ve miyelin dejenerasyonu gibi dinamik süreçler en iyi gerçek zamanlı olarak incelenmiştir. Ancak, çürük temelli yaralanmalar ve hareket eserler olmayan odak doğa karşılaştıyüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak zorlu birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında. Burada anlatılan ex vivo omurilik modeli aksonal şişme, sfero oluşumu, akson Transeksiyon, ve gerçek-zamanlı olarak bu dinamik süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlayan şişme peri-akson olmak üzere klinik olarak anlamlı kontuzyon / sıkıştırma kaynaklı aksonal patolojilerin çeşitli yönlerini taklit eder. Bu modelin önemli avantajları doğrudan akson ve ikincil yaralanma mekanizmaları yaralandı birincil hakaret arasındaki farklılaşmayı sayesinde mükemmel bir uzaysal çözünürlüğü vardır; doğrudan Perfüzat banyo kablosunu reaktif kontrollü infüzyon; Çevre ortamın kesin değişiklikler (örneğin kalsiyum, sodyum iyonları, aksonal yaralanma, ama imkansız yakın bilinen katkıda in vivo işlemek için); onlar görselleştirmek için bir fırsat olarak ve kemirgen modeller de bir avantaj sunuyoruz vegenetik belirlenen hücre popülasyonları ve hücre içi yapıları manipüle. Burada, biz izole etmek ve görüntü farelerin yaşayan omurilik akut aksonal yaralanma dinamiklerini yakalamak için nasıl açıklar.

Introduction

Akson Dejenerasyon nörotravma, inme, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere birçok nörolojik koşulları kapsayan morbidite önemli bir nedenidir. Periferik sinir sistemi (PNS), santral sinir sistemi aksine (MSS) aksonlar kez nedeniyle iç ve dış engelleri (yani, miyelin dejenerasyonu sırasında skar oluşumu sırasında üretilen ve serbest aksonal büyüme inhibitör molekülleri) ¹ hem yaralı yenilemek için sınırlı bir kapasiteye sahip ^-7. Bu engellerin çeşitli yaygın araştırdı olmasına rağmen, tedavi amaçlı müdahaleler, MSS akson dejenerasyonu önlemek sağlam aksonal rejenerasyonu teşvik ve fonksiyonel connectively geri, sınırlı kalmaktadır.

Bir kez soma ayrılmış aksonlar akson şişlik, sfero oluşumu ve ⁽⁸ gözden) nihai parçalanma ile karakterizedir Wallerian dejenerasyon olarak bilinen dejenerasyonun bir basmakalıp sürecine tabi. Içindekontrast, nakledilen periferik akson soma ile süreklilik kalır proksimal güdük, sonraki aksonal rejenerasyon için hayati bir ön koşul gerekli, bir ucunda şişlik oluşturan geri Ranvier yakın düğüme ölür, ve sonra büyüme konisinin oluşumunu başlatabilir ^9-11. Buna karşılık, birçok aksonlarda proksimal akson uçlarının, karakteristik "endbulbs" veya retraksiyon ampuller oluşturan büyüme konileri oluşturur, ve bunun yerine uzak onlar yaralanma ^12-15 sonraki ay kalır yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. Primer aksonal hasara ek olarak, ek akson hasarı / kaybı da büyük ölçüde ilk yaralanma bağışladı akson oluşabilir. Başlangıçta bağışladı akson Bu gecikmiş akson kaybı gibi ikincil aksonal dejenerasyon denir. Yaralanma MSS akson Bu doğal tepki fonksiyonel aksonal rejenerasyon beyin ve omurilikte ulaşmak için daha da zor hale golü.

Ha ne kadaraksonal yaralanma (örneğin, sfero oluşumu, retraksiyon ampuller) ve llmarks iyi ölüm sonrası doku ve aksonal dejenerasyon deneysel modellerden karakterize edilmiştir, bu dinamik süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması sınırlı olmuştur. Bu çalışmaların çoğu doğal zamanla bireysel akson yanıtları yakalamak için başarısız statik uç nokta gözlemlere dayanıyordu. Gerçi dışsal olarak aksonal izleyiciler statik bölümlerden ve canlı görüntüleme sırasında aksonal yanıtları aydınlatmak için yararlı olmuştur uygulanan genetik olarak kodlanmış aksonal belirteçlerin kullanılabilirliği floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak aksonlar görselleştirmek için yeteneğimizi oldukça geliştirdi. Nitekim, Kerschensteiner ve meslektaşları bir seminal rapor ilk spinal dorsal sütunları kendi projeksiyonlarını göndermek nöronların alt kümelerinin yeşil floresan proteinini kodlayan Thy1 GFP-S fareleri kullanarak in vivo aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon doğrudan kanıt sağladıkord ^16. Canlı görüntüleme iki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM) kullanarak yaklaşımları ve ilgi hücrelerin genetik floresan protein etiketleme gibi aksonal dejenerasyon, Ca ^{2 +} sinyalizasyon, aksonal rejenerasyon, astrosit fizyolojisi gibi birçok farklı dinamik süreçlere doğrudan kanıt ve mekanik anlayış vermeye devam mikrogliyal fizyolojisi ve yaralanma ^17-25 yanıt.

Akson aksine, çok az gerçek zamanlı olarak yaralanma miyelin tepkilerinin bilinmektedir. Miyelin PNS CNS ve Schwann hücrelerinde oligodendrositler tarafından üretilen ve tutulan beyaz cevherin önemli bir bileşenidir. Miyelin akson yüzeyinin% 99 yalıtım ve böyle yaparak son zamanlarda Buttermore ark. ²⁶ tarafından gözden hızlı ve verimli saltatory darbe yayılımını destekleyen bir yüksek direnç, düşük-kapasite koruyucu kaplama sağlar. Biz solvatokromik, lipofilik kullanmak yaralanma miyelin dinamik tepkisini yakalamak içinFloresan boya Nil kırmızısı ^27. Bu hayati leke solvatokromik özellikleri fiziko-kimyasal ortamına ^28,29 bağlıdır emisyon spektrumunun spektral vardiya izin verir. Bu özellikler axomyelinic yaralanma mekanizmaları anlamak için yararlıdır ve uygun seçilmiş dichroics ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntülendi veya spektral mikroskopi kullanılarak ²⁷ çözülebilir. Örneğin, Nil Kırmızısı emisyon spektrumu mavi-kaydırılmış örneğin adipositler ve normal bir merkezi sinir sistemi miyelin (tepe emisyon ~ 580-590 nm) ²⁷ bulunan bu gibi daha az polar lipid bakımından zengin ortamda bulunmaktadır. Buna karşılık, ~ 625 nm akson olarak oluşturulmuş endbulbs içinde bu hayati boyanın emisyon spektrumu zirveleri aksonal tepe kurumalarına ²⁷ uğrarlar. Normal miyelin karşı endbulbs içinde özellikle bu spektral vardiya altında yatan kesin mekanizmalar belirsiz kalmasına rağmen, bu tür spektral değişiklikler, protein birikimi veya dağınıklığı yol altında yatan değişiklikler gösterebilirhidrofobik bağlama bölgelerinin ²⁷ maruz kalma.

In vivo görüntüleme kendi doğal ortamında omurilik aksonal yaralanma dinamiklerini gözlemlemek için nihai metrik iken, bu teknik açıdan zor ve önemli bir cerrahi uzmanlık gerektirir, ve sık sık (örneğin, inflamasyon ve yara deneysel eserler tanıtmak olabilir dorsal sütun açığa ameliyatları tekrar formasyonu). Buna ek olarak, pahalı ekipman genellikle mikroskop objektif mercek altında sağlam bir hayvanın süspansiyon ve konumlandırma izin vermek için gereklidir. hayvanlar dikkatle sıvılar doldurulan sağlamak için, nedeniyle uzamış anestezi görüntüleme oturumlara hipoksi hiçbir işaret olmadığından emin olmak için, sıcak kalmasını sağlamak için de izlenmesi gerekir. akson ve miyelin kesinlikle canlı kalması için sürekli perfüzyon ve yeterli oksijen seviyelerini gerektiren ikinci derece önemlidir. Ancak, bu genellikle bildirilen veya in vivo çalışmalar çoğu izlenmeztarihi. Buna ek olarak, kalp hızı ve solunum için hareket eserler (izofluran yetişkin fare anestezi: ~ dakika başına 300-450 atım (BPM)% 97-98 oksijen doygunluğunu (Normal oranı ~ 632 BPM) ve korumak için en uygunudur ~ 55-65 nefes dakika başına kaçınılmaz bu hareketin tabidir sırasıyla)) ³⁰ bile hızlı lazer taramaları zorlu yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında karşılaşılan (Normal oranı ~ 163 dk başına nefes olduğunu) eserler. Uyanık hayvanlarda kemirgen omurilik görüntüleme izin verebilir bir implante sert vertebra çerçeveli pencere ile kombine ultra hızlı rezonans tarayıcıları gelişmeler, ancak daha hızlı tarama kez kaçınılmaz gürültü oranı aşağılayıcı görüntü kalitesi sinyali azaltır. Şu anda beyin görüntüleme için kullanılan spinal kord görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler daha fazla bu engellerin birçoğu üstesinden gelmek ve ina tarafından tanıtıldı potansiyel boşa sınırlayabilirdequate doku perfüzyon, örneğin, ^31-33.

Beyaz cevher fizyolojisi ve beyaz cevher hasarı mekanizmaları hakkında bildiklerimizin çoğu vitro veya optik sinir, periferik sinir ve omurilik beyaz madde ^34-41 şeritler beyaz madde ex vivo hazırlıklarında kullanılarak tespit edilmiştir. Çevresel faktörler değişiklikleri, canlı doku uyuşturucu ve reaktiflerin kontrollü uygulama, elektrofizyoloji kullanarak fonksiyonel değerlendirmeler ve akson doğrudan floresan mikroskop gözlemleri ve miyelin kontrollü izin gibi bu hazırlıklar beyaz cevher hasarı mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için devam ediyor. Ancak, daha önceki bazı yaklaşımlar kaçınılmaz yakından karşı akson yanıtı etkileyebilir çıkarma aşamasında yüzey aksonları zarar omurilik dorsal kolon şerit veya ventral beyaz cevher şeritler aksonlar gözlemlemek için. Yukarıdaki deneysel manipülasyonlar yararlanmak ve A.Ş. zarar görmemesi içinomuriliğin dorsal doğrudan temasını engeller soruşturması kapsamında ry lifler, biz bir ex vivo servikal spinal kord modeli kullanın. Böylece, pia mater ve komşu yüzeysel dorsal kolon akson mimarisi izolasyonu sırasında canlı ve soğukkanlı kalır.

Yaralanma sonrası 10+ saat – İşte onlar dinamik 8 gerçek zamanlı bir odak yaralanma cevap olarak, merkezi miyelinli akson doğrudan görselleştirme sağlar nispeten basit bir yaklaşım açıklar. Lazer kaynaklı omurilik yaralanması (Lisci) modeli mekansal zamanla kısıtlı kalır primer lezyon (ablasyon sitesi) gibi birincil ve ikincil aksonal yaralanma mekanizmaları arasındaki farklılaşmayı izin verir. açık banyo görüntüleme odası terapötik müdahale, reaktif teslimat ve çevre manipülasyonlara erişilebilir. Putatif axomyelinic koruyucu maddeler hızla doku sürecini kapsayan uzun ve masraflı deneyler karşı doğrudan gözlemlerle gerçek zamanlı olarak değerlendirilebiliring, bu nedenle, immün, görüntü yakalama ve analiz kesit ve canlı hayvanlarda deneysel maddeleri test etmeden önce akut yanıtları ve koruyucu manipülasyonlar değerlendirmek için yararlı bir vekil model sunar.

Protocol

NOT: Tüm hayvan prosedürleri Federal düzenlemelere bağlı kalarak, Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde gerçekleştirildi.

Düşük Ca ²⁺ ve 2 mM Ca ^{2 +} Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (aCSF) 1. hazırlanması guruplarına

1. Tablo 1'de açıklandığı gibi 2x düşük Ca ^{2 +} (0.1 mM) Stok C tampon, 2x, normal Ca ^{2 +} (2 mM) Stok bir tampon ve 2x Stok B tampon hazırlayın. Bireysel stok solüsyonları iyon içeriği değiştirilmesine izin (örn, düşük ya da sıfır, Ca ^{+ 2)} ve bir aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
2. Diseksiyon sırasında intrakardiyak perfüzyon için, 1x düşük Ca ²⁺ aCSF yapmak için plastik bir şişenin içine 2x düşük Ca ^{2 +} Stok C 100 ml ve 2x Stok B 100 ml ekleyin. Mix ve 4 ° C'de gece boyunca saklamak veya taze yapmak.
3. Imag sırasında ex vivo olarak omuriliğin perfüzyon içining 1x aCSF oluşturmak için bir 1 L'lik bir cam şişe içine 2 x normal bir Ca ^{+ 2} Hazır A 500 ​​ml ve 2 x stok B 500 ilave edin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında gece boyunca depolamak ya da taze olun.
4. 7.4 aCSF tampon pH ayarlayın. Oda sıcaklığında aCSF tutarken, buz üzerinde düşük Ca ^{2 +} aCSF yerleştirin ve kabarcık karbojen gazı ile iki tampon (% 95 _O2;% 5 _CO2) 30 dakika önce, perfüzyon sırasında sürekli olarak kullanmak için.

Ex Vivo Görüntüleme Odası 2. Hazırlık

1. ACSF şişe etrafında bir ısıtma battaniye (hayır otomatik kapanır) sarın ve düşük / orta ayarda ısı ayarlayın.
2. Şekil 1A 'da gösterildiği gibi iki kutuplu bir sıcaklık kontrol ve geri besleme sıcaklık probu vasıtasıyla kontrol edilir ısıtıcı bir perfüzyon pompaya ve hat-içi bağlı şişe içine özel bir CSF perfüzyon hattı yerleştirin.
3. 2-foton uyarma / conf düz bir mikroskop sahne eki (152 x 102 mm) takınocal mikroskop sahne bir dökülme kabı ile donatılmış.
4. Büyük bir açık-banyo perfüzyon odasına yerleştirin (G x U x Y; 12 x 24 x 8 mm) dökülme kabına (uygun ex Şekil 1B görmek uyum ve ex vivo omurilik taze oksijenli aCSF sürekli akışını sağlamak için ) odası tasarımı görüntüleme vivo.
5. Uygun boru kullanılarak ex vivo görüntüleme odasının giriş-line ısıtıcının metal çıkış portuna bağlayın. Görüntüleme sırasında tampon / doku sıcaklığını korumaya yardımcı olmak için, ex vivo görüntüleme odasının altında ince bir emici pedi yerleştirin.
6. Çıkarılabilir yapışkan yapışma kullanarak dökülme konteyner / sahne ucun altına ex vivo görüntüleme odasına uyun. yapışkan tack malleability AMAÇ ışık yolu doku yüzeyine dik olduğundan emin olmak için gerektiği gibi odası ayarlanır sağlayacaktır. Gerekirse, bölme ayarlamak için bir daireye düzeyini kullanır.
7. Güvenli birbölmesi sıvı girişinin yakınına, ısıtıcısı geri besleme sıcaklık probu ve oda çıkışında bir elektrik hattına bağlı bir paslanmaz çelik emme tüpü. Manyetik bant ve uygun mikropipet sahipleri, bu bağlamda da faydalıdır. Vakum kaynağı açın.
8. Oksijenli aCSF ile görüntüleme odasını dolduran başlamak için perfüzyon pompası açın. Dakika başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlayın.
9. Vakum hattı ayarlayarak görüntüleme odasında aCSF düzeyini kontrol eder. Bu omurilik kesimi kapsayacak ve su daldırma objektif ve doku yüzeyi arasında yeterli çalışma mesafesi sağlamak için görüntüleme odasının yeterli aCSF olması önemlidir. Doku segmenti tamamen için deneyci kaynaklı eserler önde gelen taze oksijenli aCSF altındayken değilse miyelin ve akson zararlı etkilenebilir.
10. Görüntüleme odasında o perfüzyon sıcaklığı oda sıcaklığına yakın yani in-line ısıtıcı sıcaklık kontrolörü ayarlayın.

<p class = "jove_title"> 3. Yetişkin Kemirgen Servikal Omurilik diseksiyonu

1. Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi sodyum pentobarbital (200 mg / kg) aşırı dozda enjekte edilerek bir yetişkin, 6-10 haftalık thy1 -YFP transjenik fare (Dorsal kök ganglion nöronlarının floresan protein ekspresyonu sahip kullanılması uygun suş) ile öldürülür.
2. Bir kez anestezi seviyesinin doğru (örneğin, ayak tutam ve göz kırpma refleksinin kaybı yok reaksiyon), dikkatle cerrahi makası ile omurilik ve beyin örten cilt tıraş altında. Betadin ve% 70 etanol yastıkları kullanarak cildi temizlemek.
3. % 70 etanol ile göğüs / karın alan Sprey, daha sonra soğutulmuş, karbojen-kabarmış düşük Ca kullanarak transkardiyal konuyu serpmek ²⁺ aCSF. (Bakınız Şekil 1C önerilen diseksiyonu tezgah üst kurmak).
4. Karaciğer sönük kalır gibi, küçük bir klip kullanarak kalbin içine perfüzyon iğne sabitleyin. Traş dorsal yüzü erişmek için konu üzerinde çevirinkonu ve% 70 etanol ile traş bölgeyi silin.
5. Beyin ve omur sütunu (Şekil 2A) maruz diseksiyon makas kullanarak kalça burun başlayarak orta hat boyunca dorsal cilt kesi yapmak. Burun ve kalça de işaretçilerine koyarak hazırlık sabitleyin.
6. Bu noktada bir diseksiyon mikroskop kullanarak, sıkıca koku ampuller düzeyinde kafatasının dorsal yüzeyi boyunca kesti. Kesi lateral kenarları içine makas ipuçlarından birini yerleştirin ve bilateral beyincik kadar takke kenarlarında kesilmiş.
   NOT: diseksiyon boyunca omurilikten örten doku kaldırmak için daha sonra gerekli gibi tamamen takke tüketim etmeyin (Şekil 2B bakınız).
7. Beyin maruz takke kaldırın. Yavaşça (beyincik bulunan) interparietal kemik sol ve sağ kenarları kesilmiş ve (beyin sapı / omurilik maruz kaudal geri Şekil 2C çekin </strong>).
8. Masa yüzeyine 45 ° açıda ince uçlu makas kullanın ve posterior sinir köklerine ikili sadece alt vertebra kesti.
   NOT: Parlak beyaz dorsal sütunları ile temastan kaçının. Bu lifler (Şekil 2B) yansıması olacak ve kolayca zarar görebilir olanlardır.
9. Keser omuriliği ortaya çıkarmak için yapılır gibi yavaşça tek parça örten doku çekerek, ince uçlu forseps ile vertebral kolonun takke ve dorsal yüzeyini kaldırın. Sonraki görüntüleme (Şekil 2E) servikal kord 1-2 cm'lik bölümünü izole etmek üst torakal düzeyde vertebra kesmeye devam.
10. Sütununun altında vertebral kolon ve net dokuya doku / kemik paralel kesmek için makas kullanın. Mümkün olduğunca aynı seviyede bu kesim yapmak. Kord görüntüleme için seviyede olacak şekilde doku bölmesi içinde olmasını sağlayacak çok önemlidir.
11. Geçmiş (beyin sapı transect için 11. neşter kullanıngracile fasikül liflerin) ve servikal spinal kord segmenti izole üst torakal düzeyde sonlandırma () Şekil 2F Bkz. Bu aynı iki noktada doku / kemik kesmek için makas kullanın. İzole doku kuyruk beyin sapı, servikal genişleme ve üst torakal spinal kord (Şekil 2G) kapsayan vertebral kolonun 2/3 içermelidir.
12. Karbojen-kabarmış, soğutulmuş düşük Ca bir petri ²⁺ aCSF içine izole omuriliğe yerleştirin. Gerekirse bu çanak düz yatıyor kadar, omurganın altında doku kırpın.
13. Ex vivo görüntüleme odasına izole belkemiğine aktarın ve 36 için 1 saat boyunca perfüzyon sıcaklık artışı – 37 ° C. Görüntüleme sırasında bu sıcaklığı korumak.

Nil Kırmızı Görüntüleme Odası ve Miyelin Etiketleme içine Ex Vivo Omurilik 4. Yerleştirme

1. Dikkatle i vertebra sütun güvenliğiniUygun bir montaj dilim ile maging odası aşağı ince lycra parçacığı oluşan dikey ızgara platformu ile modifiye tutun (Şekil 3A görmek omurilik için yer sağlamak için ızgara platformu orta Konuları kaldırmak).
2. (DMSO içinde 5 mM'lik bir stok ve süzüldü 0.22 um, 4 ° C, ya da karanlıkta -20 ° C'de 6 ay, 1 ay boyunca saklanabilir) Nil kırmızısı bir kısım çözülme. Sadece görüntüleme odasına Nil Kırmızı eklemeden önce, perfüzyon pompa akışını azaltmak ve odasında sıvı daima omuriliği kapsar emin olmak için vakum hattı ayarlayın.
3. Kord (Şekil 3B) kaudal ucuna yakın görüntüleme odasına 5-10 ul Nil Kırmızı stok solüsyonu ekleyin. Yavaşça oda boyunca, Nil Kırmızısı karıştırmak için 1 ml pipet kullanın. Nil Kırmızı, sonra 1-2 dakika odasında kalmak geri vakum hattı koyun ve sürekli omuriliği serpmek için min başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlamak için izin ver.
4. Dikkatle mikroskop sahne yükseltmeksuya daldırma hedefi odasında aCSF yüzeyinden yaklaşık 10 mm kadar ve omurilik segmentinin merkezi ve medial dorsal sütunlar üzerinde hedefi hizalayın. Hafifçe aCSF yüzeyine temas edene kadar yavaşça aşağıya hedefi getirmek için mikroskop burun parçası odak tekerleğini kullanın. Görüş alanı (Şekil 3C) içine dorsal sütunları odaklanmak bir epifluorescent ışık kaynağı kullanın.

TPLSM ve Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Fare Omurilik 5. Ex Vivo Görüntüleme (Lisci)

Not: arka damar ince yapılı fasikül elyafları gibi doku merkezi için yararlı bir marker sağladığını (sırt kök ganglion hücre gövdesinden çıkan ve T6 arasından çıkmak ve aşağıdaki omurilik orta hat boyunca), bu kan damarı paralel uzanır. kalın YFP + servikal dorsal kök projeksiyonları da lifler yükselmek gibi yararlı bir işaretleyici sağlamak ve Y yanal inmekKüçük bir çapa sahip olan AP + ince yapılı fasikül lifleri.

1. Spinal kord dokusu uygun hizalanmış sonra, lazer tarama moduna geçiş artan gracile fasikül miyelinli liflerin temel görüntüleme gerçekleştirmek için. Hem YFP ve Nil Kırmızı heyecanlandırmak için, floresan emisyon izole etmek 950 nm dalga boyunda (~ bir 25X, 1.1 NA amacı çıkışında ölçülen 17 mW) ve uygun dichroics (DM) ve bant geçiren filtreler için ayarlanmış bir iki-foton lazer kaynağı kullanın fluorophores (biz sarı-turuncu, kırmızı ve genişletilmiş kanalları, sırasıyla içine YFP ve Nil Kırmızı ayırmak için, 525/50 DM560, 600/60 DM640 ve 685/70 kullanın).
   1. Akson fazla% 3 temel görüntüleme (30-60 dakika) sırasında aksonal sferoidler gösteriyorsa nedeniyle deneyci kaynaklı eserler hazırlık atın.
2. 30.3X görüş alanını büyüterek bir Lisci indükleyin (bir ~ 20 mikron çapında ablasyon oluşturmak için). Dinle 800 nm lazer ve en ~ 110 mW için lazer gücünü artırmakÖrnek. Lifler tamamen transeksiyon sağlamak için görünüm lazer taramaları 5 tam alanını izin verin.
3. (Numune, 2.08X de 950 nm, 17 mW) görüntüleme ayarlarına geri lazer ayarlarını değiştirerek Lisci onaylayın ve ablasyon görselleştirmek için doku tarayın. Ablasyon çapını doğrulayın ve birincil ablasyon aksonlar tamamen transeksiyon olduğunu (Şekil 3D bakınız). Yaralanma sonrası 8-10 + saat kadar yaralanma akson ve miyelin dinamik tepkisini kaydetmek için z yakalama ile birlikte mikroskop zaman atlamalı ayarlarını kullanın.
   NOT: ablasyon eksik ise (yani, liflerin eksik yaralanması), şaşırmış olacak birincil ve ikincil yaralanma mekanizmalarının belirlenmesi gibi, hazırlık atın. Buna ek olarak, izole spinal kord segmentleri Lisci bağımsız doku hasarı orta sadece hafif 24 saat sonrası Lisci kadar görüntülü olabilir.

Representative Results

Discussion

Bu yüzey görüntüleme ex vivo olarak omurilik miyelinli aksonlar (yani, ince yapılı fasikül) zaman içinde hem birincil hem de ikincil miyelinli aksonal dejenerasyon dinamik ilerlemesini incelemek için bir lazer kaynaklı, omurilik yaralanması ile birleştirildi. Ex vivo görüntüleme için bir yöntem tarif Omurilik gibi hareket eserler ve uzun süreli görüntüleme oturumları sırasında deneyci kaynaklı hipoksi potansiyeli olarak in vivo görüntüleme ile ilişkili komplikasyonların çoğu üstesinden gelir. Bu protokol oksijenli guruplarına düşük Ca içeren ²⁺ ve örten aksonal liflerin hasar, dorsal sütun veya ventral beyaz cevher şerit hazırlıkları sırasında sık karşılaşılan gerileme önler kullanarak omuriliğin tüm servikal segmenti ayırır. Ayrıca önce veya Ca örneğin, modifikasyonu (omurilik yaralanması aşağıdaki izole spinal kablonun mikroçevresinin işlemek için araştırmacı sağlar ²⁺konsantrasyon ve / veya farmasötik reaktiflerin eklenmesi).

Transeksiyon, kontüzyon veya akson geniş bir alanı etkileyebilir SCI modelleri ezmek aksine, Lisci son derece odaklı doğası birincil yaralanma (transected akson) ve daha sonra meydana gelen ikincil akson hasarı aynı anda çalışma sağlar. tarif edilen ex vivo görüntüleme ve LISCI protokol demiyelinizasyon, mikroglia dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi bulunan bağışıklık hücreleri tarafından uyarılan nöro ve anoksik / iskemik hasar mekanizmaları da dahil olmak üzere beyaz madde yaralanma diğer bileşenleri araştırmak için kullanılabilir. Diğer yüzeysel bulunan spinal beyaz cevher yolları görüntüye yapılabilir geçerli protokol veya değişiklikler gibi bu çalışmalar da dorsal kolon akson odaklanmak olabilir. Ayrıca, diğer transjenik veya çift transgenik fare suşları, aynı zamanda merkezi sinir sistemi bulunan hücrelerin aktivasyonu / aktivitelerini incelemek için bu protokol ile kullanılabilir.

Pek çok kritik con vardırex vivo omurilik, bir murin başarılı izolasyonu ve görüntüleme için uzaklaştırmıştır. Birincisi, aCSF tamponlar hipoksi önlemek için oksijenli tuttu gerekir. Spinal kord sırasında ve izolasyondan sonra oksijenli aCSF batık edilerek nemli tutulmalıdır. Diseksiyon sırasında, bu tür omurga segmenti altında doku temizlerken omuriliği bükme / çok sıkıca örten doku geri çekerek ve germe gelen aşırı basınç gibi omurilik mekanik stres en aza indirmek için en iyisidir. Üstelik / dokunmatik omurilik dorsal sütunları sıkıştırmak asla önemlidir. Bir hipertermik ortamda omurilik dokusu stres olabilir çünkü görüntüleme odasının optimum aCSF perfüzyon sıcaklığı bakımı da önemlidir.

Aksonlar tamamen Lisci sırasında nakledilmiş olduğundan emin olmak için, bu lazer ablat sırasında potansiyel doku hareketini en aza indirmek için ex vivo odasında doku segmenti hareketsiz önemlidiriyonu temsil etmektedir. Ayrıca istenilen ablasyon yerinde doku (objektif lens dik) görüntüleme odasında düz durmalıdır. Lisci seviyesi değil sonraki görüntü analizi komplike ve genel görüntü netliğini azaltır eğik ablasyon neden doku üzerinde gerçekleştirdi. Son olarak, lazer ablasyon doku derinliği Lisci sonuçlarını etkileyebilir. Biz ablasyon civarında 12-15 mikron pia mater altında olması için odak noktası ayarlamanızı öneririz.

Akson ve miyelin yaralanma mekanizmaları incelemek için bu ex vivo görüntüleme yöntemi kullanılarak önemli bir sınırlama Lisci aşağıdaki periferik kanından alınan hücrelerin etkileri tespit edilemez olduğunu. Bu bir terminal modelidir Dahası, yaralanma aşağıdaki davranışsal ve rejenerasyon sonuçları değerlendirildi edilemez. In vivo görüntüleme ile paylaşılan bu ex vivo Lisci görüntüleme modeli bir kısıtlama nedeniyle güçlü ışık sc karar olma yeteneğine sahip derinliğiOmurilik beyaz maddenin özelliklerini içeriğinde değişikler yapmak. Böylece, bu ex vivo omurilik görüntüleme modeli, öncelikle omurilik dorsal yüzeyi boyunca yer beri görselleştirmek için en erişilebilir lifler dorsal kök ganglion duyusal nöronlar artan merkez projeksiyonlar üzerinde duruluyor. Böyle bu protokol belgelenen artan duyusal akson kıyasla yaralanma sonrası farklı tepki verebilir, motor aksonlar azalan gibi diğer miyelinli akson yolları. In vivo ve bizim ex vivo görüntüleme protokolü ile hem görüntüleme için başka bir ortak sınırlama görüntüleme süresi. Bu ex vivo yöntem akut yaralanma mekanizmaları okuyan mükemmel bir araç iken, aynı ex vivo doku segmentinde görüntüleme uzun vadeli boyuna aksonal değişiklikler olanaksız olabilir. Biz normalde görüntü herhangi bir kayda değer Lisci bağımsız doku hasarı olmadan Lisci sonra 6-10 saat izole omurilik dokusu; Ancak, biz bir omurilik segmenti görüntülü varkaynaklı yaralanma ilgisiz sadece orta doku bozulması ile 24 saat sonrası Lisci kadar. Spinal kord segmenti uzun süre için görüntülendi Ancak, kaçınılmaz lazer ablasyon bağımsız olan bazı doku dökümü olacaktır. Bizim teklif ex vivo omurilik Lisci modelinde bu sınırlamalara rağmen, yeni yeteneği etkinliğini değerlendirmek için gerçek zamanlı olarak birincil ve ikincil yaralanma yaralanma ayırt -kalkış bu ex vivo omurilik görüntüleme ve Lisci modeli elde edilebilecek bilgi İlaç reaktifler ve çevresel manipülasyonlar yaralanmas yaralanma aşağıdaki dinamik akson mekanizmaları ve miyelin yanıtları içine değerli fikir verebilir sonra.

Materials

Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing 
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin