Bu rapor, TriKinetics Drosophila Activity Monitor kullanılarak Drosophila larva aktivitesini ölçmek için bir yöntemi açıklar. Cihaz, 16 adede kadar bireysel hayvanın hareketlerini algılamak için kızılötesi ışınlar kullanır. Veriler, oranlar ve hayvanların tahlil odaları içindeki konumları dahil olmak üzere hareket parametrelerini temsil etmek için analiz edilebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Drosophila larvaları birçok davranışsal çalışmada kullanılmaktadır, ancak larva aktivitesinin temel parametrelerini ölçmek için basit bir cihaz mevcut değildir. Bu protokol, larva aktivitesini incelemek için genellikle yetişkin aktivitesini ölçmek için kullanılan bir alet olan TriKinetics Drosophila aktivite monitörünü (MB5 Çok Işınlı Aktivite Monitörü) yeniden kullanır. Cihaz, tüp başına 17 kızılötesi algılama ışını kullanarak 16 ayrı 8 cm'lik cam tahlil tüpünde hayvanların hareketlerini izleyebilir. Kayıt yazılımı, verileri otomatik olarak bir bilgisayara kaydeder, hareket sayısı, sensörlerin tetiklenme zamanları ve hayvanların tüpler içindeki konumları gibi parametreleri kaydeder. Veriler daha sonra genel hareket ve/veya konum tercihinin yanı sıra diğer ölçümleri temsil edecek şekilde analiz edilebilir. Tüm verilere kolayca erişilebilir ve temel grafik ve veri işleme yazılımlarıyla uyumludur. Bu protokol, aparatın nasıl kullanılacağını, yazılımın nasıl çalıştırılacağını ve baştan sona bir larva aktivite testinin nasıl çalıştırılacağını tartışacaktır.
Giriş
Drosophila'nın genetik bir araç olarak kullanılması, biyolojik sistemler hakkındaki bilimsel bilgiyi dönüştürmüştür. Drosophila larvaları, nosisepsiyon1, gelişim2 dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda ve insan hastalık genleri3'ün incelenmesi için bir model olarak kullanılmıştır. Drosophila aktivitesi, sıcaklık2, ilaçlara maruz kalma4 ve farklı genotipler dahil olmak üzere farklı koşullar altında değişen bir dizi davranışı kapsar. Yine de, larvaların bir model organizma olarak önemli ölçüde kullanılmasına rağmen, larva aktivitesini analiz etmek için basit, standartlaştırılmış bir yöntem mevcut değildir. Şu anda, birçok larva hareketi çalışması, gelişmiş video analiz yazılımı kullanmaktadır5. Güçlü olsa da, bu tür otomatik araçların karmaşıklığı, hareketin incelenmesi için henüz donanımlı olmayan laboratuvarları, çalışmalarına bilgilendirici aktivite parametrelerinin analizini dahil etmekten caydırabilir. Izgara tarama analizi gibi diğer mevcut otomatik olmayan yöntemlerde, hareket bir insan gözlemci tarafından puanlanır, bu da öznellik olasılığını ortaya çıkarır ve verimibir seferde 6-7 hayvanla sınırlar. Benzer bir çalışma, larvaların belirli bir doğrusal mesafeyi8 kat etmesi için geçen süreyi ölçen 5 şeritli bir tarama testi kullandı. Bu tür otomatik olmayan tahlillerde, yer değiştirme ölçülür, ancak bu, başlangıç ve bitiş noktaları arasındaki doğrusal olmayan hareketi hesaba katmaz. Aşağıda tartışıldığı gibi, burada açıklanan yöntem gerçek larva hareketinin daha fazlasını açıklar, objektiftir, kullanımı kolaydır ve sağlam verim sunar.
Doğruluk, verimlilik veya maliyetten ödün vermeden larva aktivite davranışını kolayca incelemek için bu yöntem, genellikle yetişkin aktivitesini incelemek için kullanılan bir cihaz olan TriKinetics Drosophila Activity Monitor'ü (DAM) kullanır. Hem yetişkin hem de larva aktivitesini incelemek için tek bir cihaz kullanmak uygun maliyetlidir ve bu iki yaşam evresinde hayvanlar tarafından hareketin doğrudan karşılaştırılmasına izin verir. Üreticinin en yüksek çözünürlük seviyesine sahip olan sistem, 16 ayrı tüp içinde sensör ışınları kırıldığında larva aktivitesini kaydeden tahlil tüpü başına 17 kızılötesi algılama ışını kullanır. Sistem daha sonra kaydedilen bilgileri otomatik olarak bir bilgisayara kaydeder ve temel grafik yazılımı ile manipülasyon için kullanılabilir hale getirir. Elde edilen veriler, tek tek larvalar tarafından kırılan kirişleri (bir hıza dönüştürülebilir), bir larva bir dedektör ışını içinde kaldığında hareketi ve bir kayıt periyodu boyunca hayvanların tahlil odaları içindeki konumunu temsil eder (pozisyon tercihinin hesaplanmasına izin verir). Sistem verimlidir ve kullanımı nispeten basittir ve Drosophila larvalarını inceleyen herhangi bir laboratuvarın ulaşabileceği yüksek oranda tekrarlanabilir temel aktivite analizi sağlar.
Bu testin gücünü göstermek için, değişen ortam sıcaklıklarından kaynaklanan aktivite farklılıklarını doğrulamak için kullanımını gösteren veriler ve daha önce hipoaktif (iav1)9 olarak tanımlanan bir mutantın geniş çapta analiz edilen bir kontrolle karşılaştırılması yoluyla sunulmuştur (w1118).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Larva hazırlanması 1.
- , Hareket ya da pozisyon tercihi için istenen larva analiz standart sinek gıda 11 kullanılarak 10 tahlil istenen yaşa standart koşullar altında larvaları büyümek için.
- Serigrafi dereceli naylon bir huni üzerinde örgü gererek bir örgü filtre yapın. Lastik bant ile huni boyun örgü sabitleyin. Bir beher huni yerleştirin.
- Analiz için larva toplamak için, bir spatula dolu kültür şişesinden kazarak larvaları içeren gıda kepçe ve bir fırça 10 örgü doğrudan bireysel larva toplama, örgü filtre üzerinde RT musluk suyu ile yıkayın.
Analiz tüpleri, 2. Hazırlık
- Tahlil tüpleri fiş hazırlamak için, dikkatle% 4 agar jel kaynatın ve 1.5 cm derinliğinde bir petri içine dökün. Hayvan kapalı olduğunda bu tüpün her iki tarafı için bir fiş sağlayacaktır. % 4 çözeltisi p larvaları önlemek için yeterince yoğundurtapaları enetrating.
- Tüpler temiz ve larva yerleştirilmesi açık önce olduğundan emin olun. Değilse, bu kaydedilen olmaktan hareketleri engelleyebilir.
- Larvalar hareketi için yeterli neme sahip olmak için, sıcak su, küçük bir miktar ihtiva eden bir sıkıştırma şişesi hazırlayın. Dikkatli bir lavabo doğru prizi yönlendirmek, şişe ters çevirin ve pikap tüp su çıkarmak için hafifçe sıkın.
- Tahlil tüpüne şişe çıkışını yerleştirin. Yoğunlaşma ince bir tabaka tüpün duvarında görünene kadar tahlil tüpüne su buharı sunmak için şişeyi sıkın. Video 1 nem uygun bir miktarda olan bir tüp içinde hareket eden bir larva göstermektedir.
- Tüp içinde larva mühür için, bir petri 1,5 cm kalınlığında agar jel kaldırmak ve agar tapa tüp içine sokulabilir, böylece agar altındaki hava akışı sağlamak için bir ağ yüzeyi üzerine yerleştirin. Bir ucuna jel iki fiş eklemek için iki kez jel içine deney tüpünün bir ucu basın.
- Bir paintb ileacele yaklaşık 1,5 inç derin tüp içine bir larva yerleştirin ve agar jel içine larva yakın ucu basarak tüp mühür. Ortaya çıkan basınç karşısında ucundan agar jeli ikinci fişini zorla ve tüp içinde hayvan mühür olacaktır.
- Yer MB5 Çok Işın Drosophila Activity Monitor (DAM) cihazdaki tüpler ve hayvanların sensörlerin aralığının ötesinde hareket edemez, böylece tüpleri konumlarını ayarlayın.
- Tüpler taşıma sırasında cihazın kızılötesi okuma çerçevesinin dışına kaydırarak olmadığını tahlil sağlamak için, her bir tüp temas kayıt cihazı etrafında macun bir halka sıkarak yerinde tüp tutun.
3. Ölçme Etkinliği
- Bir kuluçka Kayıt aktivite nedeniyle gölgeler, floresan ışıkları veya laboratuarda sıcaklık değişimlerine oluşabilecek yanlış okumaları önlemek için. Sistemin önerilen bir düzenleme için Şekil 5'e bakınız.
- 20 ° C (Şekil 1) bir inkübatör ayarlayın. , Kayıt sırasında nedeniyle akkor ışık kaynaklarından gelen parazit yanlış kayıtları önlemek floresan inkübatör ışıkları kapatmak ve inkübatör kaydederken, ayrı bir LED ışık kaynağı kullanın. Anormal sensörleri tetikler olmadığını ışık koşulları sağlamak için herhangi bir hayvanlarda olmayan bir deneme yapın. Bu testten sonra hiçbir kayıtlı hareketi verileri olmalıdır.
- Larva deneyi başlatmak için önce 5 dakika için 20 ° C inkübatör ayarlarına gelmesini izin verir.
- İstediğiniz kayıt aralıkları (örneğin, 1 dakika) BARAJI Sistemi ayarlamak için, DAM sistemi kayıt yazılımı bilgisayar 12 barındırmak ve PSIU arayüzüne kayıt odasına bağlanmadan önce BARAJI Sistem dosyayı açmak için indirilen olduğundan emin olun.
- Daha sonra veri kaydedileceği istenilen kayıt frekansı seçin tercihlerini ayarlamak ve farklı zaman dilimlerini seçmek için yukarıdaki veya okuma aralığı seçeneği aşağıdaki linke tıklayınız hangi verilersaklanacaktır. Örneğin, 1 saat 1 sn den aralık kez okuma seçin.
- , Veri kayıt için değişen parametreyi seçin tercihleri seçin ve çıkış veri türü altında gelen kutularını seçmek için (sayar, hamle, pozisyonları ve bekleme, bakınız Tablo 1). Her parametre tüpü içinde larva faaliyet eşsiz bir analizini sağlar.
- Kayda başlamak CAB6 telefon kablosunu kullanarak Güç Kaynağı Arabirim Ünitesi (PSIU) monitörü bağlamak için. Bir elektrik prizine bağlayın PSIU. Yeşil ışık uygun bağlantıyı gösterir.
- Veri kayıt için Macintosh veya Windows PC için Universal Serial Bus (USB) kablosu aracılığıyla PSIU bağlayın. Otomatik veri kaydını başlatmak için bilgisayarda BARAJI SystemMB1v6x programını açın.
- İstenilen toplama süresi tamamlandıktan sonra, Quit seçin ve ardından DAM etkinlik ekranda şimdi çıkın; Bu veriler daha sonra otomatik olarak DAM Sistemi Verileri altında kaydedilir. Bu veri dosyası alın (örn: 1 monitör) ve sürükle ayrı bir klasör içine. Daha sonra işlenebilir, böylece bu DAM yazılımı ham verileri saklamak olacaktır.
İşleme Veri Hazırlama 4. (DAM FileScan)
- Anlaşılabilir bir biçime ham verileri işlemek için DAM FileScan uygulamasını açın ve Select Input Veri Klasörü seçin. Sonra veri klasörü ve istediğiniz dosyayı seçin ve tarama seçeneği seçin. Son olarak istenen okuma dönemine bin uzunluğunu seçin. Bu operatör tarafından ayarlanan parametrelere ham verileri düzenlemek ve program söz konusu aralıkta toplanan verileri rapor edecektir.
- (Monitör sayısı, hamle, bekleme) istenen hareket ayarını analiz etmek için çıkış veri türünü seçin. İlave okumalar menüsü altında kutusu içine seçin toplamı (bu bin uzunluğu seçilen sistem okuma aralığından daha büyüktür ise).
- Uygun Dosyayı adlandırın ve kaydedin. Dosya aşama 3.9 klasörü ile aynı yerde saklanır.
- Önceden kaydedilmiş dosyayı (adım 4.3) açın, ortalama hamle süreci bir elektronik tablo programı bir tablo oluşturmak için 4. adımdan elde edilen ham veriler toplamak ve metin ithalat sihirbazı penceresi göründüğünde, seçeneğini bitirmek açmak için Bir çizelge formatında veri dosyaları.
Not: analiz veri türüne bağlı olarak, elektronik tablo farklı okunacaktır. Her okuma tüpü belirlenmiş bir mektup alacaksınız Tipik olarak, çalışmanın süresi sayısal kaydedilecektir monitör hamle veya sayıları ölçmek için. Elektronik tablodaki verileri görüntülerken, sütunlar tahlil tüpleri 1-16 sırasıyla yuvaları temsil kz. satırlar Toplanan veriler noktalarını temsil eder. - Hareket 1 dakika aralıklarla 20 dakika boyunca toplanmış, örneğin, hareket / dakika ve diğer ölçümlerin ortalama sayısını hesaplamak için 20 satır ortalama.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1, yedi farklı sıcaklıklarda larva hareketin farklılıkları tespit etmek için izleme cihazı kullanılarak, 1.118 w kontrol üçüncü instar larvaları bir sıcaklık yanıtı çalışmasında, elde edilen sonuçları gösterir. Larvalar yıkandı ve yukarıda tarif edildiği gibi DAM aktivitesi cihazı içerisine yerleştirilmiş ve istenen sıcaklığa ayarlanmış bir inkübatör içine yerleştirildi. Kayıt başlamadan önce Cihaz daha sonra 5 dakika boyunca ortama alışmaları sağlandı. Her bir larvaya ayrı ayrı 20 daki...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Drosophila larvalarının aktivitesi genotip 8, 13 yaş ve ortam sıcaklığında 2 de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere etkilenir. Çok detaylı analiz yapabilen, güçlü videographic yöntemler lokomosyon 5 çalışma olanların geliştirilmiş olmasına rağmen, ayrıntı bu düzeyde etkinliğinin temel parametrelerini belirlemek isteyenler için gereksiz olabilir. Burada anlatılan yöntem, birçok laboratuvarda mevcut bir cihaz, kullanımı kolay istihdam yüksek tekrarlanabilir sonuçlar üretir ve hat...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH tarafından I. Meng'e P20GM103643 desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Drosophila Activity Monitor, Multibeam, teller dahil 16 tüp | TriKinetics Inc. | MB5 | |
| Güç Kaynağı Arayüzü | TriKinetik A.Ş. | PSIU24 | |
| Cam 80 x 5 mm tüpler (100) | TriKinetics Inc. | PGT 5x80 | |
| DAMsystemMB1v6x Veri Toplama Yazılımı | www.trikinetics.com | Macintosh | |
| www.trikinetics.com | ücretsiz indirilebilir | için DAMFileScan 108x yazılımını | |
| . | www.trikinetics.com | ücretsiz indir | |
| DAMSystem Notes 308 | www.trikinetics.com | ücretsiz indirin | |
| Zeiss Stemi 2000C- Stereo Mikroskop | Spektrum Hizmetleri | SP-STEMI2000C-BS | |
| Karbon Dioksit | Maine Oxy | anestezi | |
| Fly Pad | Genesee | 59-114 | anestezi uygulanmış sinekleri ayırmak için yüzey |
| Küçük boya fırçası | Winsor & Newton | # 2 ROUND | veya benzeri, anestezi uygulanmış sinekleri ayırmak için kullanılır |
| Serigraf Baskı Mesh (160) | msj-gallery.com | SM160W63-3YD | gözenek boyutu bu protokolde kullanılan ~ 0.1 mm idi |
| Tegosept | Genesee | 20-258 | koruyucu |
| Etanol (190proof) | Pharmco | 111000190 | Tegosept |
| 6 oz Kare Tabanlı Şişeyi (PP) | 32-130 | ||
| "Flugs" | Genesee | 49-100 | |
| Drosophila Şişeleri, Geniş (PS) | Genesee | 32-117 | |
| Geniş plastik şişeler için Flugs | Genesee | 49-101 | |
| Sarı Ölçülü Mısır Unu Altın | Madalya | ||
| Drosophila agar | LabScientific | FLY 8020 | |
| Ekmek Mayası - Red Star | King Arthur Unu | 1270 | |
| Toz Şeker - Ekstra İnce | Domino |
Kaynaklar
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila.gene essential for nociception. Cell. 113, 261-273 (2003).
- Ainsley, J. A., Kim, M. J., Wegman, L. J., Pettus, J. M., Johnson, W. A. Sensory mechanisms controlling the timing of larval developmental and behavioral transitions require the Drosophila.DEG/ENaC subunit. Pickpocket1. Dev. Biol. 322 (1), 46-55 (2008).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila. melanogaster.and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol. Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Cattaert, D., Birman, S. Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila.larvae. J. Neurobiol. 48 (1), 58-73 (2001).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila. hordotonal organ mutants. PNAS. 100 (26), 16053-16058 (2003).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. (61), (2012).
- Godoy-Herrera, R. The development and genetics of digging behavior in Drosophila. arvae. Heredity. 56, 33-41 (1986).
- Sinadinos, C., Cowan, C. M., Wyttenbach, A., Mudher, A. Increased throughput assays of locomotor dysfunction in Drosophila. larvae. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 325-334 (2012).
- Homyk, T., Sheppard, D. E. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. I. Isolation and mapping of mutations which decrease flight ability. Genetics. 87 (1), 95-104 (1977).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila. larvae. J. Vis. Exp. (63), e3837(2012).
- Model Organisms I: yeast, Drosophila and C. elegans. Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education-database/3/essentials-of-biology-1-yeast-drosophila-and-c-elegans (2015).
- Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the spontaneous locomotor activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449(2014).
- Troncoso, B., Godoy-Herrera, R., Waldo, M. The development of larval movement patterns in Drosophila). Heredity. 58 (1), 321-329 (1987).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian rhythm of the locomotor activity in Drosophila. melanogaster.and its mutants ‘sine oculis’ and ‘small optic lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- Johnson, A. W., Carder, W. J. Drosophila, ociceptors mediate larval aversion to dry surface environments utilizing both the painless TRP channel and the DEG/ENaC subunit, PPK1. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
