Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Bağışıklık yetkili sıçanların plevra boşluğuna II-45 mezotelyoma hücrelerin nakledilmesi ile plevra malign mezotelyoma ortotopik sıçan modelinin üretimi sunulmuştur. Bir akış sitometrik yöntemi de tanımlanan bir 25 ul kan örneğinden, bu hayvanlarda, yedi immün hücre alt analiz etmek.

Abstract

Bu tür aşıların ve bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri ve tedavi yanıt tümör mikro rolü artmış anlayış kanseri için bağışıklık bazlı tedavilerde ilgi muazzam kabarış, toplu klinik öncesi testler için immün yetkili ortotopik modellere ihtiyaç işaret Bu yeni tedavilerin. Bu yazıda plevral malign mezotelyoma ortotopik bağışıklık yetkili sıçan modeli kurmak için nasıl gösterir. Ortotopik modellerde İzleme hastalığın ilerlemesi tümörlerin iç konuma göre şaşırmış. Uzunlamasına hastalığın ilerlemesini bu ve diğer kanser fare modellerinde immün hücreleri, dolaşımdaki üzerindeki etkisini izlemek için, tek bir tüp sadece 25 ul tam kan açıklanan gerektiren tahlilinde akış sitometrisi. Toplam lenfositler, monositler ve nötrofiller, hem de T-hücre alt CD4 ve CD8, B-hücreleri ve doğal katil hücreler: bu, doğru yedi bağışıklık parametrelerinin ölçümü sağlar. Farklı subsBu parametrelerin ets mezotelyoma modelde hastalığın ilerlemesinin izlenmesi için en büyük yararı olan lenfosit oranı nötrofil ile farklı koşulları ve model yararlıdır. Ayrıca bağışıklık bazlı tedavilere yanıtın izlenmesinde ve tedavi başarı ya da başarısızlığa yol açan altta yatan mekanizmaların anlaşılmasında yardımcı olabilir bu tek tüp yöntemi kullanarak bağışıklık hücre düzeylerinin dolaşan Analiz.

Introduction

Malign mezotelyoma (MM) membran (mesothelium) dönüştürülmüş hücrelerden kaynaklanan saldırgan malignite olduğu satırları akciğer ve karın boşlukları, kalp ve iç üreme organları ve akciğer boşluğuna veya plevra ^1,2 en sık görülen primer tümör . Asbest liflerine maruz kalma tüm MM% 80'ini ve asbest kullanımına ilişkin yasakları en batı ülkelerinde yıl önce tanıtıldı olurken, toplumdaki yaygın kullanımı ölümcül bir miras bırakmıştır. Dünya Sağlık Örgütü 107.000 kişi dünya çapında artmaya devam ölüm oranları ile, asbest ilgili hastalıklar her yıl ölmektedir tahmin ediyor. Yeni bir meslek dışı insidans dalgası da ortaya çıkmaktadır ve bu ³ zirve zaman ve hangi düzeyde küçük anlayış var.

Sistemik kemoterapi tek geçerli seçenek ⁴ birini temsil ettiğinde MM ile insanların büyük çoğunluğu geç teşhis edilir. En effectikemoterapi ve (cisplatin ⁵ ile birlikte pemetrexed) geçerli 'bakım standardını' ziyaretinde 10 yıl önce tespit edilmiştir. Bu tedavinin Ancak başarısızlık kaçınılmazdır ve sadece 12 ay ² sert bir prognoz ve medyan sağkalım hastaları bırakarak kanıtlanmış ikinci satırı seçenekleri vardır. Bu nedenle, daha etkin tedavi için acil bir karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Klinik çalışmalarda yeni tedavilerin bir dizi incelemede karşın, hiçbiri uygulamada değişiklikler ile sonuçlanmıştır. Bu klinik ^6-8 ayar genellikle ksenograft fare modellerinde gerçekleştirilen ön klinik sonuçlar, düşük (% 5) aktarım, kısmen bağlıdır. Bu tür modeller sadakatle sıklıkla bağışıklık sistemi ⁹ yokluğunda, fizyolojik olmayan yerlerde meydana gelen tümör mikro-ortamınm karmaşık yönleri özetlemek yoktur.

Singenik ortotopik modeller c göre belirgin daha gerçekçi tümör ortamı yaratmaktümörler bozulmamış bağışıklık sistemi ^10,11 ile doğru fizyolojik konumda ortaya gibi ommonly derialtı ksenograft modelleri kullanılmaktadır. Sıçan büyük boyutta özellikle seri kan tedavi yanıtını ve toksisite ¹² değerlendirmek için gerekli olan berabere ilaç çalışmalarında, bir kemirgen hastalık modeli olarak kullanımını geliştirir. Bundan başka, bir model olduğu hastalık ilerlemesini takip dolaşımda bulunan faktörler son derece çekici kullanılarak hastalığın ilerlemesini izlemek için yeteneği nedeniyle, (plevral boşluğuna gibi) tümörlerin konuma zordur. Bağışıklık yetkili fareler kullanılarak plevral mezotelyoma bir singenik ortotopik model üretimi tarif edilmektedir. Buna ek olarak, dolaşımdaki immün hücre ölçülerek plevral hastalığı ilerlemesinin izlenmesi için kolay ve göreceli olarak invazif olmayan bir yöntem de tarif edilmektedir.

Protocol

Hayvanları da içeren tüm prosedürler Bilimsel Amaçlarla Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Uygulama Avustralya Kanunu tavsiyeleri doğrultusunda yürütülmüştür. Bu çalışma için protokol Kraliyet North Shore Hastanesi Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından onaylandı. Kadın Fischer 344 fareleri (F344, 150-200 g), Kearns Tesisinde muhafaza edilmiştir, standart koşullar (12 saat ışık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve suya serbest erişim) altında Kolling Enstitüsü. Not: Tüm deneysel işlemleri için bir akış şemasıdır, Şekil 1 'de sunulmuştur. İmplantasyon için Hücrelerin hazırlanması 1. (Aynı zamanda IL-45 olarak da bilinen krosidolit asbest periton sokulmasıyla elde edilen) Kültür sıçan mezotelyoma II-45 hücre hattı RPMI 1640 (RPMI) ortam (37 °,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş ve standart koşullarda büyümeye % 5 CO2) C nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı. Mainta75 cm 2 balonuna pasajlayarak ve iki alt kültürleme yaklaşık 01:50 Haftada tarafından. 37 ° C'de hücre kültürü ve sıcak alikotları için reaktifler hazırlayın. Gerekli reaktifler,% 10 FBS, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve% 0.5 tripsin-EDTA ile, serum içermeyen RPMI ortamı (SFM), RPMI bulunmaktadır. Yaklaşık 70-80% konfluansa implantasyon için kültür hücreleri. Bu da doğrusal büyüme aşamasında olmasını sağlar. Medya atarak steril PBS, 5 ml ile bir kez yıkanması ve daha sonra 3 ml% 0.5 tripsin EDTA ekleyerek Hasat hücreleri. Tüm hücreler, yapışmayan olana kadar yaklaşık 5 dakika boyunca inkübatör şişeler dönün. Hücreler yapışmayan olduğunda, tripsin inaktive% 10 FBS ile RPMI 3 ilave edin. Toplama ve santrifüj hücreleri 3 dakika boyunca 300 xg'de. 3 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar santrifüj SOY ve 10 ml hücre pelletini yıkayın. 10 SOY ml ve santrifüj yukarıdaki gibi tekrar yıkayın hücre topağı. SFM 10 ml hücrelerin tekrar ve bir hemasitometre ve benzeri cihazlar kullanılarak bir hücre sayımı gerçekleştirin. 100 ul implante edilecek hücrelerin miktarını ihtiva ettiği şekilde hücreleri ile seyreltilir. Not: Tümör büyümesi 100 100 ul hücre fakat standart bir doz 100 ul 500,000 hücreleri gibi düşük bir dozda gösterilmiştir. Sıçanların sayısı (yani, 100 ul / fare) implante edilebilir için ortam yeterli hücrelerini hazırlamak artı astarlama ve iğne ölü hacminden kayıplarını telafi etmek için, en az 0,5 ml ilave. Hazırlama (hücreler olmadan) yeterli SFM kontrol farelerinde (örneğin, 100 ul / fare) içine implant edilmek üzere, ayrıca, en az 0,5 ml ilave. Hücreleri ve SFM artık implantasyon için hazırız: Not. Onlar 37 o C'de tutuldu ve canlılığını korumak için hasat 2 saat içinde implante edilmelidir. Hücreler 2. in vivo İmplantasyon Indüksiyon odasına F344 sıçan (> yaşı 13 hafta) yerleştirin ve% 1,4 izofluran inhalasyonu (ya da tesiste kullanılan yöntem) ile uyutmak. Sıçan (akan% 1.4 izofluran ile) burun konisi için odadan uykuda hareket onu olduğu göründüğünde, (ventral görünüm) yukarı bakacak şekilde göğüs ile sırtında yerleştirin. Bu iç organları uzakta göğüs boşluğundan yerleşmek için izin verir. Sıçan sağlamak için kurumsal protokollere göre refleksleri kontrol tamamen uyuşturulduktan. Kürk çıkarmak için sağ regio costalis (göğüs) alan tıraş. % 80 v / v etanol ile traşlı alanı temizleyin. Enjeksiyon bölgesini belirleyin: Sağ tarafta, 2 bezi kranial başlayan bulabilirsiniz. Enjeksiyon sitesi göğüs kafesinin kuyruk ucundan 3. ve 4. kaburga arasında, bu 0.5 cm proksimalinde olduğunu. (Şekil 2A). Yavaşça tekrar süspansiyon II-45 hücreleri karıştırın. Yavaşça 1 ml hücre süspansiyonu (veya kontrol sıçanlar için SFM) çizmek ve# 160; ekli bir iğne olmadan şırınga. Bir iğne hücrelerin çizim up bağlıysa hücreler iğne, enjeksiyon hattı boyunca büyümek için potansiyeli vardır. Bir 23G x 1 ¼ iğne takın. Başbakan makaralı ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. Şırınga ve iğne astarlanmış sonra, iğne mili üzerinde 20 mm uzunluğunda ve 5 mm çapında bir boşluk yerleştirin. Bu enjeksiyon sırasında plevra boşluğuna çok derin nüfuz iğne önlemek için kullanılır. Maruz kalan iğne Yaklaşık olarak 5 mm-12 mm bir organların zarar vermeden kaburga nüfuz için yeterlidir. Yavaşça, kaburgaların arasındaki iğneyi bir kan damarı (kan şırınga içinde görünmelidir) daha sonra 100 ul hücreleri veya SFM enjekte delinmiş olmamıştır sağlamak için şırınga geri çekin. (Şekil 2B). İğneyi çıkarın ve yavaşça göğüs boşluğunda hücreleri yaymak için yanlara doğru sıçan yuvarlayın. Bir kafese sıçan yerleştirin ve kurtarma için kontrol edin. The sıçan 1 dakika içinde uyanık ve hareket başlıyor olmalıdır. Yeni bir iğne kullanarak her sıçan için tekrarlayın. Aynı iğne tekrar kullanımı iğnenin enjeksiyon hattı boyunca hücre büyümesinin neden olur. Günlük hayvanların refahını izleyin. Kurumsal hayvan etik komitesi tarafından yönetilir olarak etik tanımlanan uç noktaları hayvanların Euthanize. Bu deneylerde sıçanlar için etik son nokta 10'dan daha fazla veya% da zor nefes alma ve ağırlık kaybı vardı. 3. Kuyruk Ven Kan Toplama Kan sonrası hücre implantasyonu hemen tahsil edilecek olursa, anestezi sıçan tutun. Başka bir zaman noktasında kan örnekleme ise,% 1.4 izofluran inhalasyonu ile sıçan uyutmak. Sıçan sağlamak için kurumsal protokollere göre refleksleri kontrol tamamen anestezi edilir. Onun yüzüne sıçan yerleştirin ve bir yanal kuyruk damarı bulun. % 80 etanol ile kuyruk sterilize ve 0.5 ml EDTA c etiketollection tüpü. Kan toplamak için, her zaman (boyunca yol yaklaşık üçte biri) kuyruk kaudal ucunda başlar. Bu ilk girişim başarısız olması halinde kuyruk kafa ucuna daha yakın girişimleri verir. Bu bir kan pıhtısı neden olabilir kaudal resample asla. Yanal ven bir 23G x 1 ¼ iğne paralel yerleştirin ve yaklaşık 10 mm (Şekil 3A) nüfuz böylece sığ bir açıyla damara doğru kaydırın. Not: Damar başarıyla delinirse olmuşsa, kan iğne (Şekil 3B) bağlanma sonunda görünür olacaktır. Bir damla kan iğne ponksiyon yerinde kuyruk oluşacaktır. Etiketli 0.5 ml (veya daha küçük) EDTA toplama tüpüne bir pipet ve transfer kullanarak bu kan toplayın. Immün hücre deneyi 25 ul için yeterlidir. Kanama durana kadar siteyi delinme basıncı ile gazlı bez uygulayın. Pr kan ve EDTA karıştırmak için kan tüpü FlickOlay pıhtılaşması. Kan toplama ve pıhtılaşmayı önlemek için mümkün olduğu kadar kısa EDTA ile karıştırılarak arasındaki süre devam edin. Analize kadar oda sıcaklığında rafa birden fareler mağaza EDTA kan örneklerinde kan toplarken. Koleksiyonun 2 saat içinde Süreç kan. Boncuk merkezli Yöntemiyle Bağışıklık Hücre Profil Oluşturma 4. Numune Hazırlama Not: Bu tek bir platform yöntemi, her numune için boncuk bilinen bir dizi var piyasada mevcut mutlak sayım tüpleri kullanılarak dayanır. Bu tüpler boncuk serbest numune hazırlama sırasında çözülür liyofilize pelet, içerirler. Boncuklar flüoresan olarak etiketlenir ve boncuk nüfus yolluk mutlak sayımlar hesaplanabilir. EDTA tam kan örneği birkaç dakika yavaş döner mikser üzerine yerleştirerek iyice karıştırılır olduğundan emin olun. Her numune için tek mutlak sayma tüp etiketleyin. Boncuklar içeren bir pelet t altında görünür olmalıdırtüpün dibinde o metal boncuk tutucu. Etiketli mutlak sayım tüpüne EDTA tam kan 25 ul aktarın. Boncuk pelet kanın ilave edilmesi üzerine eriyecektir. Her bir tüpe, anti-sıçan T / B / Doğal Katil (NK) hücre kokteyli 20 ul anti-sıçan CD8a PE 10 ul anti-fare CD4 (alan 1) FITC 10 ul ve anti-sıçan 10 ul CD45 PE / Cy7 (Şekil 4A). Flüoroforlar Tablo 1 'de tanımlandığı gibidir. Antikorlar ve hücreler, tüpün alt ve tüpün yanına yapışmış olmayan sağlamak için boru kısa bir süre (300 xg) santrifüjleyin. Girdap karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe. Kırmızı kan hücreleri 10 mM Tris, 400 ul lize etmek için, 0.15 M amonyum klorür tamponu (pH 7.5) ve vorteks karıştırın. Numune saydam ve bulanık değil (Şekil 4B ve C) göründüğünde lizis tamamlandı. Numune tamamen artmasına sebep olacağı parçalamak için başarısızlıkd arka plan ve flow sitometri ile analiz ederken yanlışlıkla sayıları yüksek. Numunelerin 5. Akış Sitometrik İşleme Not: akış sitometresi 4 renk gerçekleştirin. Şekil 5 de gösterildiği gibi, tedarik etme kipi ve 8 parsel ile yeni bir şablon yazılım açın. Tablo 1'de listelenen ve kapı R1 kurmak olanlara cihaz ayarlarını yapın (FITC [FL-1] APC [FL-4] karşı), Şekil 5ai) floresan boncuk saymak için. Diğer kapılar bu satın alma aşamasında önemli değildir ama analiz için gerekli olacaktır. Bu protokolde kullanılan mutlak sayım boncuk floresan boyalar içeren ve mavi kanalda zayıf olmasına rağmen herhangi bir kanalda tespit edilebilir. Hazırlanmış bir kontrol kan örneği, vorteks kullanarak ve sonra Sitometre üzerine yüklemek ve veri toplama kapıları ayarlanabilir, böylece kurulum modunda düşük hızda (12 ul / dak) çalışacak. Edinimi ayarlayınR1 boncuk kapısı 10.000 olayları toplamak. Veri kaydetmek ve satın alma menüsünden dosya numarasını ve etiket örnek dosya ayarlamak için bir klasör oluşturun. Numune sitometresinin üzerine analiz edilecek yerleştirin ve orta (35 ul / dk) akış hızını ayarlamak. Aynı akış hızında her bir örnek çalıştırın. Akış hızı (12 ul / dakika) düşük ya da (60 ul / dakika) yüksekten değiştirilebilir gerekebilir, ancak orta genellikle uygundur. Bu hızla her numune için 10,000 boncuk olayları elde etmek için yaklaşık 90 ila 120 saniye sürüyor. Numune emin olaylar R1 boncuk kapısında görünen emin olmak için dağılım araziler izlemek yüklendikten sonra. Başlangıçta saçılım araziler sürüklenme neden örnek baskısı bazı istikrarsızlık olabilir. Bu stabilize etmek için bekleyin. Stabilize sonra edinilen tıklayın ve örnek çalışmasına izin. Sitometresinin R1 10.000 boncuk olayları satın bittikten sonra sitometresinin elde durdurmak ve tüm verileri kaydetmek olacaktır. Numuneyi çıkarın ve tu akış atınolacak. Sitometresinin şimdi bir sonraki numune için hazırdır. Tüm örnekleri çalıştırın ve daha sonra analiz moduna geçin. 6. Bağışıklık Hücre Analizi Not: yolluk stratejileri ve Boole cebri her hücre popülasyonu tanımlamak için kullanılır. Boole cebri, tek bir tanımı birden operasyonlar için izin veren bir mantık tabanlı analiz yöntemidir. (Örneğin, BD CELLQuest) Akış Sitometre analiz yazılımı Boole cebri kullanımı için izin verir. Denklemler daha özel olarak her bir hücre popülasyonu tespit hücre tanımlanmasında yardımcı önemli bir negatif reaktiflik için aktif hesap için kullanılır. 'Bölgeler' bir 'kapıyı' tanımlamak için kullanılır. (- Tablo 2 'de tanımlandığı +, *) kapıları cebirsel operatörler tarafından bağlanmış bir çok bölgesine oluşur, oysa bölgeler 2 boyutlu bir boşluk tanımlar. Analiz moduna yazılımı geçin. Bir analiz şablonu maç için oluşturulan edilmelidir <strong> gösterilen araziler ve kapıları ile Şekil 5. Ayrı ayrı her bir dosyayı (örn, her numune) analiz edin. Tablo 2'de tarif edildiği gibi ayarlama kapıları R1 R9 üzerine ve sonra, (aynı zamanda, Şekil 5'de gösterildiği gibi), her hücre türü için algoritmaları ayarlayın. Kapıları ve algoritmalar (Tablo 2 ve Şekil 5) tarafından tanımlanan bireysel hücre popülasyonlarının hesaplamak için hücre istatistik sayacı kullanın. Algoritmalar hücre istatistik sayaç otomatik olarak hücre sayıları ayarlayacaktır. Aşağıdaki denklem kullanılarak hücre alt hesaplayın: Not: sayılan hücre olayların sayısı (örneğin, CD4 T hücre olaylar) kan ul başına hücre sayısını vermek için yukarıdaki denklemi kullanılarak numaralandırılmış. Örnekleri, Şekil 5 de gösterilmiştir.

Representative Results

II-45 hücreleri kullanılarak plevral mezotelyoma ortotopik modeli üretimi için bu çalışmada kullanılan yöntem, hiçbir sıçan implantasyon yöntemi nedeniyle ölüyor ile, tekrarlanabilir ve hızlı bir süre içinde mezotelyoma yenik hayvanlarda sonuçlandı. Implante edilen hücre sayısı titrasyon 1 x 10 3 hücreleri, tam nüfuz modeli (100% melezleme) için gerekli olan en az sayıda olduğunu tespit ettik. Sıçanlarda implante hücrelerin farklı sayıda hastalığın şiddetini etkileyen gö…

Discussion

Bu yazıda plevral mezotelyoma bir sıçan singenik ortotopik model ve boyuna kan örneklemesi yoluyla hastalığın ilerlemesini izlemek için basit bir yöntem oluşturulması için bir yöntem ayrıntıları.

II-45 modeli asbest liflerine ¹³ Fischer 344 fareleri açığa tarafından geliştirilmiştir. Bu poz mezotelyoma patogenezinde konak-asbest bağışıklık sistemi etkileşimlerinin gerçek dinamiklerini temsil rağmen, uzun bir gecikme süresi (üretmek için yıllar ala…

Materials

EDTA Collection tube (0.5ml)	Greiner Bio One GmbH	450480
Rat T/B/NK Cell cocktail	BD Pharmingen	558509	anti-Rat CD3  APC (IgM clone 1F4), anti-Rat CD45RA Fitc (IgG1 clone OX-33), anti-Rat CD161a PE (IgG1 Clone 10/78)
anti-RAT CD8a PE	Biolegend	200608	(IgG1vClone G28)
anti-Rat CD4 FITC (Domain 1)	Biolegend	203406	(IgG1 Clone OX-38)
anti-Rat CD45 PE/Cy7	Biolegend	202214	(IgG1 Clone OX-1)
TruCount™ Tubes	Becton Dickinson	340334	Box of 50 absolute counting tubes
RPMI 1640 media	Life Technologies	11875-119
foetal bovine serum (FBS)	Scientifix	FBS500-S (lot# 010101-1)
trypsin-EDTA	Life Technologies	15400-054
PBS tablets	Medicago AB	09-9400-100
23Gx1¼ Needle	Becton Dickinson	302008
1mL Syringe	Becton Dickinson	302 100
Fischer 344 Rat	Animal Resources Centre, Perth Australia	F344
I.S.O (Isoflurane USP)	Veterinary Companys Australia (VCA)	B7058
II-45 Rat Mesothelioma line	Zurich University		Note: The cell line was given as a gift and is not commercially available at the ATCC
FACSCalibur™ 4 colour	Becton Dickinson	342975
TRIS-HCL	SIGMA	T3253
Ammonium Chloride	SIGMA	9718
Anaesthetic Machine (The stinger)	Advanced Anaesthesia specialists	#00449