Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

domuz prenatal programlama içine Araştırma gelişen embriyonun veya fetüsün cinsiyet gelişim sonucunu etkilemeye göstermiştir. Bu nedenle, bir embriyonun cinsiyetini belirleme yeteneği özellikle erken gelişimi ile ilgili birçok deneyler gereklidir. Bu protokol, PCR ile kullanım için domuz genomik DNA ucuz, hızlı ve toksik olmayan hazırlanmasını ortaya koymaktadır. Gün 30 embriyolar insanca mevcut protokol için Kurumsal Hayvan Politikası ve Refah Komiteleri tarafından oluşturulan kurallara göre toplanan gerekir. Bu PCR bazlı cinsiyet tayini tekniği bütün embriyo hazırlanması sadece önceden soğutulmuş bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde donmuş embriyo taşlama içerir. PCR kalitede DNA alkalin liziz reaktifi sıcak inkübasyon uygulayarak embriyo tozu küçük bir miktar serbest bırakılmaktadır. Daha sonra, DNA solüsyonu nötralizasyon tamponu ile karıştırılmış ve PCR için doğrudan kullanılmıştır. İki primer çiftleri DETEC için oluşturulacakyüksek doğruluk ve özgüllük ile X- kromozomunun Y kromozomu (SRY) ve ZFX bölgenin bölgesini belirleyen t özgü seks. aynı protokol gün daha önce başka bir uzun embriyolar (gün 14 gün 10) uygulanabilir 30. otomasyon ve yüksek için uygun hale embriyo çok sayıda tarama Ayrıca, bu protokol 96 dönüştü plakalı yapılabilir verim seks yazarak.

Introduction

yerli domuz, insan ve hayvan sektörlerinde gelişme, genetik ve beslenme temel bir araştırma konusu haline gelmiştir. insan araştırma için biyomedikal model olarak domuz potansiyel fizyolojik benzerlikler isnat edilebilir. Hayvancılık, cinsiyet oranı manipülasyon seçimi ve genetik iyileştirme programları ¹ etkinliğini artırabilir. Bireysel embriyolar sexing dahil ancak erken embriyo gelişimi ² sırasında genotip, epigenetik ve cinsel dimorfizm X inaktivasyonu ile sınırlı değildir, birçok deneysel araştırmalarda kullanılan temel bir araçtır.

Farelerde yapılan çalışmalar, anne beslenme ve diğer faktörler, cinsiyet dengesizliği ³ neden olabileceğini düşündürmektedir. Domuzlarda, cinsiyet oranı dengesizlik nedenleri baba cins ^4, rahim kapasitesi ^{5 ve} sow metabolik durumunu ⁶ içerir. embriyolar ve yavrularına gözlenen farklılıklar se etkilemiş olabilir berixual dimorfizm araştırmacılar araştırma ile ilgili kararınızı vermeden önce embriyo cinsiyet ve cinsiyet oranları farkında olmalıdır. gelişme 30. günde domuz embriyolar sexing verimli araçlar ve protokollerin geliştirilmesi burada ele alınacaktır.

seks yazarak çeşitli yöntemler model organizmaların ve hayvancılık genetik çalışmalar için geliştirilmiştir. Özellikle hayvancılık, erkek ve kadın erken embriyolar belirlenmesi ıslah programları için genetik seçimi geliştirmek için çok yaygın bir uygulamadır. Giemsa ^{7 veya} yoğun floresan ^8,9 teknikleri kullanılarak domuz Karyotipleme erken embriyolar seks yazım için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu metodlar zaman alıcı ve hızlı ve doğru bir şekilde embriyo sayıda taranması için uygun değildir.

En etkili seks yazım metodu, ısı sabit DNA polimeraz ve bir çift primer kullanılarak DNA amplifikasyon. PCR yöntemi ile DNA cinsiyet tayini O, daha özel bir hızlı ve duyarlı birnly hücresel malzemelerin bir dakika miktarda gerektirir. İlk PCR tabanlı embriyo cinsiyet tayini insanlarda ¹⁰ üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra fareler ^11, sığır ^12, manda, koyun ^{13 14} pre-implantasyon embriyoları oldu. Domuz, erken DNA seks yazarak yöntemi Y-kromozomu spesifik DNA primerleri ¹⁵ tek çifti üzerinden pre-implantasyon embriyoları için kurulmuştur. Bununla birlikte, cinsiyet tespiti için en yaygın PCR primerleri, bir erkek spesifik SRY ¹⁶ ve X ve Y ^kromozom 17 hem de yer alan bir çinko parmak geninin olmayan seks ayırt bölgenin Y kromozom seçilmiştir. Daha sonra, bu primer, bir çinko-parmağı genin sadece X kromozomu tespit etmek için primerler geliştirilmiş özgüllük bu çalışmada gün 30 embriyo cinsiyet belirleme uygulanmıştır.

domuz pre-implantasyon embriyoları genomik DNA proteinas tamponu için sağlam bir blastosist maruz bırakılarak elde edilebilire K ¹⁶ veya bireysel erken bölünme birkaç hücre biyopsi alarak ¹⁵ embriyolar ve direkt PCR için bunları kullanarak. Bununla birlikte, domuz kanı, saç, dokular ya da boyut olarak birkaç santimetre üzerinde büyük konseptus DNA salgılanmasının etkin bir şekilde proteinaz K yöntemiyle yapılmaz. Bu malzemeler için DNA ekstraksiyon yöntemleri zaman alıcı fenol / kloroform protokolleri ⁶ ya da pahalı sütun tabanlı kitleri ¹⁸ kullanılarak kurulmuştur. potansiyel olarak toksik kimyasalların kullanımını önlemek için, ucuz, kolay ve fenol içermeyen DNA ekstraksiyon yöntemleri geliştirmek için bir eğilim vardır. Fare ¹⁹ ve zebra balığı ²⁰ dokularından elde edilen kalite genomik DNA izolasyonu için protokol Bu tür sıcak sodyum hidroksit ve tris (Hotshot) kullanılarak kurulmuştur. Bu çalışma, PCR seks için Hotshot değiştirilmiş ve yeniden tasarlanmış dubleks primer çiftleri Günün hücre lizatları 30 domuz embriyolar ile doğrudan yazarak DNA elde etmek için bir protokol sağlaryüksek doğruluk.

Protocol

Hayvan Bakımı yönergelere Kanada Konseyi ile ve Fakülte Hayvan Politikası ve Refah Kurulu onayı gereğince – Alberta Üniversitesi'nden Hayvancılık, hamile sows gebelik ve embriyo 30 toplandı yaklaşık Gününde eğitilmiş personeli tarafından ötenazi uygulandı. işlemleri sırasında her zaman muayene eldivenleri kullanın. 1. Örnek Toplama ve Numune Depolama kansız bırakılarak, ardından tutucu cıvata kullanılarak ekmek öldürülür. Her ötenazi ekmek üreme yolları ve embriyolar toplamak için muayene eldiven giyin. Not: örnekler ve embriyo transferi hızlı toplama buz veya sıvı azot gibi mikrodizi ve qPCR gibi diğer moleküler işler için daha yüksek kalitede dokularda neden olur kuru. Rahim incelemek ve yavaşça yatan rahim duvarından 21 kendi extraembryonic plasental membranların içindeki tüm embriyolar ayırın. Hiçbir anne doku kirlenme olduğundan emin olun. Yenidendonma önce tüm canlı embriyoların kordon uzunluğu ve ağırlığı. her embriyo toplayın ve hemen ek sıvı azot ile dondurma önce bir alüminyum folyo içinde tamamlamayı. doğrudan -80 ° C derin dondurucuda sıvı azot dondurulmuş embriyolar transfer. 2. Öğütme Embriyolar numune sayısı için gerekli Numune No Tüm numune tüpleri (15 mi) etiketi analiz edilecek. yarım dolu kuru buz ile ısı kabı doldurmak ve kuru buz içinde önceden etiketlenmiş örnek tüp yerleştirin. Buz kabı kuru ° C derin dondurucuda -80 önceden soğutulmuş harç ve havan aktarmak için üst muayene eldiveni başka bir çift ile kış eldiven giyin. kuru buz üzerinde harç içinde donmuş embriyo yerleştirin. embriyo kapak ve ince bir toz haline tokmak ile öğütmek için yeterli bir sıvı azot dökün. Bir MICR ile önceden etiketlenmiş numune tüpü embriyo toz transferiospatula (Şekil 1) ve -80 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin. Her embriyo için temiz bir ön-soğutulmuş havan kullanın ve örnekler arasındaki çapraz kontaminasyonu engellemek için her bir embriyo öğütüldükten sonra muayene eldivenleri değiştirin. 3. Genomik DNA Hazırlama Sodyum hidroksit Yöntemi Modifiye kullanarak numune sayısı için gerekli etiket Tüm mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mi), analiz edilecek. elde edilen embriyo tozu içeren örnek tüplerini aktarın -80 ° C derin dondurucuda bir kapta kuru buz ile önceden başlamadan. Her bir önceden etiketlenmiş mikrosantrifüj tüpüne 50 mM NaOH (sodyum hidroksit) ile 180 ul pipet. 95 ° C'ye kadar bir kuluçka öncesi ısı açın. 50 mM NaOH çözeltisi ihtiva eden bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpüne Örnek borusundan embriyo tozun doğru miktarda (yaklaşık 5-10 mg) (Şekil 2) aktarmak için bir kürdan. u çekinp aynı kürdan yavaş yavaş bir yapışkan, aşırı duygusal, beyaz, şeffaf benzeri bir madde (Şekil 3) DNA lizatı görselleştirmek için. Beş dakika süre ile 95 ° C'de önceden ısıtılmış bir inkübatör DNA lizat ile mikrosantrifüj tüpleri aktarın. Hemen buz dolu bir strafor kutu tüp aktarın. doğrudan mikrosantrifüj tüpüne 1 M Tris-HCI 20 ul ilave edin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın. PH santrifüj önce yaklaşık 8.0 (Şekil 4) sağlamak için pH kağıdı kullanın. Not: Örnek hazırlıkları çok sayıda uğraşırken, rastgele pH'ı kontrol etmek birkaç örnek almak kabul edilebilir. çözülmemiş doku çöküntüsü ortadan kaldırılmaktadır oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 2,000 xg DNA lisatı ile tüp santrifüjleyin. Devri, yeni bir tüp içine, berrak yüzer 150 ul ya da 96 gözlü plakalar. Not: berrak DNA lizat PC şablon olarak kullanıma hazırR, reaksiyon ve iki hafta içinde 4 ° C'de stabildir, ya da, bir yıl boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir. 4. Tasarım Sex-spesifik PCR primerler NCBI web sitesinden http://www.ncbi.nlm.nih.gov gelen Domuz seks belirleyici bölge Y (SRY) için katılım numaralarını (NM_214452.3) ve ve çinko parmak protein X'e bağlı (ZFX) genleri (XM_005673501.1) elde /. Kopyala ve bir online astar tasarım aracı bu NCBI erişim numaraları yapıştırın. Not: Uzunluk, Tm ve GC% olarak PCR ürün hacmi (bp), bilgisayar ekranında oluşturulur (Şekil 5) de dahil olmak üzere iyi primerler bilgileri. Bu dizilerin yalnızca sırasıyla SRY ve ZFX (Şekil 6) X ve Y kromozomu üzerinde yer sağlamak için mevcut domuz genomik veri tabanında 104 karşı nükleotit Blast programı (BLASTN) kullanarak bu primerlerin özgüllük doğrula. Doğrudan DNA Lisatlar 5. genomik DNA, PCR kullanım15 ul PCR reaksiyonu için şablon olarak DNA, lizat yalnızca 1 | il. Not: 96 oyuklu plakalar PCR için bir yüksek veri akışı tarama yöntemi, bir çok kanallı pipet kullanarak benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. İlk PCR için aşağıdakileri yapın: ticari olarak elde bilinen seks domuz genomik DNA 1 ul (0.5 ng) ekleyerek hiçbir şablon negatif kontrol ve pozitif kontroller için iki ek borular için bir PCR tüpü hazırlayın. Daha sonra, bir pozitif kontrol olarak, son başarılı cinsiyet tayini analizi bir örnek vardır ve cinsiyet tespiti için yeni bir PCR reaksiyonunda ile birlikte çalışır. Herhangi bir HotStart hazır karışım PCR enzimi kullanın ve ekleyerek primerler tarafından ana karışımı hazırlamak ve PCR reaksiyonlarının toplam sayısına bağlı olarak ücretsiz su nükleaz. PCR Master Mix 14 ul önceden var olan bir PCR tüpü içerisine DNA lizat için 1 ul ekle. primerler ekleme gibi, iki cinsiyete spesifik genlerden primerlerin nihai konsantrasyon 15 | il PCR r, toplam 0.3 uM olduğunu,eaction. termal siki üs cihazında Aşağıdaki PCR programı ayarlama: 3 dakika, 95 ° C 35 döngü 15 saniye uzatma adımı, ardından 65 ° C'de 15 saniye tavlama aşamasına ve ardından bir 20 saniye Erime aşama 98 ° C, her 72 ° C'de. Son bir adımda, 72 ° C'de 1 dakika için reaksiyonlar inkübe ve cinsiyet belirlemek için jel elektroforezi doğrulama için PCR tüpü çıkarılması kadar 4 ° C'de inkübe devam etmektedir. Not: PCR koşulları ve optimizasyon Malzemeleri Tablo belirtilen PCR kiti kılavuzuna göredir. % 2 TBE agaroz jel hazırlanırken, toksik olmayan yeşil-floresan SYBR DNA jel leke uygun miktarda ekleyin. Not: mevcut değilse Ethidium bromür sera floresan leke ikame edilebilir. PCR tüp içine yükleme boyası (10x) 1.5 ul ekleyin ve PCR reaksiyon tamponu yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. oyuk ve r içine örnek yüklenebilir 10 ulun uygun voltaj ayarlarıyla agaroz jel (boya bant kadar 100 V küçük jel cihaz, 150 V, 96 oyuklu jel aparatı jeli içinden yarım çalışır). Gözlemleyin ve bir lazer tarayıcı kullanılarak floresan ışığı ayarı altında bantları yoğunlukları ayarlayın ve jel bir görüntü yakalamak. Not: Genel jel görüntüleyici etidyum bromür jel için ikame edilebilir. Bir kadın olarak bir bant ve bir erkek olmak üzere iki bant (Şekil 7) ile embriyolar tanımlayarak domuz embriyoların cinsiyeti belirlemek.

Representative Results

PCR ile 345 DNA Lizatlar taramadan cinsiyet tayini temsili bir sonuç Şekil 7'de gösterilen ve Tablo 1'de özetlenmiştir. Şekil 7'de görüldüğü gibi, 65 ° C 'de primer tavlama ısısı farklı örnekleri arasında, bu PCR protokolü içindeki yoğunluk ve esas amplikon boyutları üretilmesi (Şekil 5) uygun bir durumdur. <p class=…

Discussion

Domuz embriyolar DNA seks yazarak ilgili mevcut protokollerin en erken evre öncesi implantasyon aşamasında ^15,16 için uygundur. Biz başarıyla Geç gebelik sırasında domuz embriyo tarama için uygun bir protokol geliştirmiştir. Daha önceki çalışmalarda ^6,18 embriyoların içindeki gelişim aşamalarında çalışmalara dayanarak, bu protokol, daha güvenli ve daha düşük maliyetli olarak kabul edilir.

Bu protokol, aynı zamanda, bir 96-yuvalı plaka için…

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.