Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Dünya Sağlık Örgütü'ne göre, dünya çapında 360 milyon insan, iş ve özel yaşamları üzerinde derin sonuçları olan işitme kaybından muzdariptir. İşitme cihazları, orta derecede işitme kaybı formlarında duyusal işlevi geri yükleyebilir; bununla birlikte, en ciddi vakalar için en etkili tedavi seçeneği, koklear implant (CI) adı verilen bir protez cihazdır. CI'ler, kokleanın skala timpanisine cerrahi olarak yerleştirilen 24 elektrottan oluşan doğrusal bir elektrot dizisi içerir. Elektrotlar, işitsel siniri ¹ oluşturan spiral ganglion nöronlarını doğrudan uyarır.

Dünya çapında implante edilen 300.000'den fazla cihazla, Kİ'ler çok başarılı tıbbi implantlardır ve şimdiye kadar bildirilen en uygun maliyetli prosedürler arasında yer almaktadır. Başarısına rağmen, koklear implantın fizyolojik işitmeye kıyasla azalmış frekans çözünürlüğü gibi sınırlamaları vardır. Bu, gruplarda veya gürültülü ortamlarda etkili iletişimde eksikliklere ve müzik gibi çok karmaşık sesleri deşifre etme becerisine yol açabilir. Bu azaltılmış frekans çözünürlüğü muhtemelen CI elektrotları ve spiral ganglion nöronları arasındaki boşluktan kaynaklanır ve bu da büyük nöron gruplarının uyarılmasına yol açar. Bu boşluk yüzlerce mikrometre aralığındadır ^2,3. Bu boşluğun ortadan kaldırılması, elektrot başına daha küçük nöron gruplarının uyarılmasını kolaylaştıracak, böylece frekans çözünürlüğünü ve cihazın genel performansını artıracaktır ⁴.

Elektrot ve nöron arasındaki boşluğun etkisini ve çeşitli optimize edilmiş stimülasyon protokollerinin etkisini incelemek için, SGN'lerin çoklu elektrot dizileri (MEA'lar) üzerindeki non-invaziv elektrofizyolojik karakterizasyonuna dayanan bir in vitro biyotahlil geliştirdik ⁵. Ek olarak, MEA'lar, nöron-elektrot arayüzünü optimize etmek için elektrot şeklini, boyutunu, malzemesini ve yüzey pürüzlülüğünü değiştirmek için kolayca değiştirilebilir. Aşağıda, murin spiral ganglion nöron kültürlerinden tekrarlanabilir bir şekilde kayıtlar elde etmek ve yukarıda belirtilen parametrelere bağımlılığı değerlendirmek için adım adım bir protokol yer almaktadır.

Hayvan bakımı ve deney İsviçre yerel yetkililer (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, İsviçre) kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Deney için Çözümler hazırlayın

1. Buz üzerinde Çözülme ECM karışımı: hücre dışı matris (ECM) kaplama çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosu, nokta 6). (Nörotrofik faktörler ve fetal sığır serumu (FBS) olmadan), temel kültür ortamında ECM karışımı 1:10 seyreltilir ve buz üzerinde muhafaza edin.
2. (Malzeme Tablosu gelin 1'e bakınız) kültür ortamı hazırlayın: FBS veya beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) içermeyen Neurobasal orta bir stok hazırlayın. hemen önce hücre kültürüne ilave taze FBS (% 10) ve BDNF (5 ng / ml) ile, Neuro temelli ortam ilavesi.
3. (Malzeme Tablosu gelin 2'ye bakınız) dışı çözüm hazırlayın.

ÇÇA 2. Yıkama ve Sterilizasyon

(Şekil 1E) içinde düzenlenmiş 68 elektrotları içermektedir. Her bir elektrot merkezden merkeze 200 um'lik bir mesafe ile 40 x 40 um bir ² boyuta sahiptir. elektrotlar platin yapılır. Elektrotlar indiyum kalay oksit yapılmış bir devre ile ilgili kişiler bağlanır. Bu devre SU-8, 5 mikron tabaka ile izole edilmiştir. sağlayıcıya ilgili ayrıntılar için malzeme tabloya bakın. Diğer MEA düzenleri Bu deneyler için uygun olabilir.

1. Yeni ölçümü için: 30 saniye için% 70 etanol içinde daldırarak durulayın ve 30 saniye süreyle damıtılmış su ile yıkayın. Laminer akış kaputu çalışın.
2. Laminer akış kaputu 30 dakika MEA kurumasını bekleyin.
3. Tek bir steril Petri kabı (35 mm x 10 mm) içine her MEA koyun ve folyo ile kapatın. kullanılana kadar taraflı çevre saklanabilir.
4. Kullanılan ölçüm için: Enzimatik solut 1 ml ihtiva eden bir Petri kabı (35 mm x 10 mm) Meas inkübeiyon biyolojik materyali kaldırmak için oda sıcaklığında orbital çalkalayıcı üzerinde O / N (Malzeme Tablo, nokta 6). Sonra adım 2.1 olarak devam etmektedir.
   NOT: bakım kauçuk kaplı ipuçları forseps kullanarak ÇÇA tutun.

Kültür Deney için ÇÇA 3. hazırlanması

1. sızdırmazlık folyoyu çıkarın ve bütün deney için Petri kabındaki (35 mm x 10 mm) MEA bırakın.
2. Kat 1.1 hazırlanan çözelti ile taraflı çevre: Bütün elektrot alanı kapsayan her MEA kaplama çözeltisi 50 ul pipetleme için (-20 ° C'de saklanan) soğuk 200 ul pipet kullanın.
3. Oda sıcaklığında 30 dakika ile 1 saat boyunca kaplamak için ÇÇA izin verir.
4. bir pipet kullanılarak kaplama çözeltisi çıkarın. % 10 FBS ve 5ng / ml BDNF ile takviyeli kültür ortamında 100 ul uygulayın ve doku kaplama kadar oda sıcaklığında bırakın.
5. Büyük bir petri (94 mm x 16 mm) içine kaplı ÇÇA içeren 2 Petri kapları yerleştirin ve 1.5 içeren üçüncü küçük petri ekleyinnemlendirme Fosfat Tamponlu Salin ml (PBS).
   Not: PBS içeren küçük bir petri (aşama 3.5) eklenmesi önemli ölçüde kültür ortamının buharlaşmasını en aza indirmek çok önemlidir.

4. Spiral Ganglion Diseksiyon

NOT: Brüt diseksiyon laminer akış kaputu dışında yapılabilir (4.4 4.1 Adım). ince diseksiyon steril koşullar (laminer akış kaput) için (adım 4.5 dan itibaren) zorunludur.

1. önceden anestezi olmadan kafaları kesilmek suretiyle hayvanlar (5-7 gün eski fareler) euthanize.
2. % 70 etanol ile püskürtülerek baş sterilize edin.
3. kafa tutarak, cilt ve sagital hattı boyunca keskin / sivri makas ile kafatası arasındaki bağlantıyı kesti.
4. sagittally kafatası kesin ve keskin / künt makas kullanarak beyin kaldırmak.
5. kafatasından temporal kemik kesin ve steril, buz kadar soğuk Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ihtiva eden bir petri bu yerleştirin.
6. Bir dissec kullanılmasıyon mikroskop, ince forseps kullanılarak timpanik bül incelemek ve iç kulak izole.
7. ince forseps kullanarak, koklea kemiği kaldırmak.
8. (SV) birlikte forseps ile spiral ganglion (SG) ve SV bazal kısmını tutarak ve yavaş yavaş-apeks -to tabanından SV gevşemek spiral ligament ve stria vaskularis kaldır
9. Corti (OC) organı izole SG ve modiolus (Şekil 1A - C)
10. forseps ile SG ve OC bazal kısmını tutarak ve yavaş yavaş tabanına-to-tepe noktasından OC gevşemek ile SG ve modiolus gelen OC ayırın.
11. Spiral gangliyondan kesin yan eksplantlar (200 çapı um ila 500), yine, bir forseps ve bir mikro neşter kullanılarak modiolus (Şekil 1D) eklenmiş.

ÇÇA 5. Spiral Ganglion Eksplantasyon Kültür

1. Daha önce 10 ile hazırlanan MEA elektrotlara önümüzdeki iki spiral ganglion eksplantları yerleştirinkültür ortamının 0 ul.
2. yaklaşık 5 mm uzakta elektrot alanından Corti organı yerleştirin.
3. doku zarar kaçınarak MEA üzerine eksplantlar ve Corti organı pin forseps kullanabilir.
4. 37 ° C'de kuvöz ve kültürün içine dikkatlice ÇÇA yerleştirin ve% 5 CO _2. Ertesi gün, görsel eksplantlar MEA bağlı olduğunu kontrol edin.
   NOT: eksplantlar O / N bağlı değil, nadiren önümüzdeki gün içinde yapacağız. OC trofik / nörotrofik destek kültür bitişik yerleştirilir.
5. Birbirini takip eden 5 gün süre ile,% 10 FBS ve BDNF gün içeren kültür ortamı 100 ul ekle.
6. 6. günde ilave 13 gün boyunca% 10 FBS ve 5ng / ml BDNF ve kültür dokusu ihtiva eden kültür ortamı 2 ml ilave ediniz.

6. Elektrofizyolojik Kayıtlar Spontan ve Elektrot Uyarım Bağımlı Etkinliği Araştırma

1. hücre-dışı MEA kültürü yıkama,dökülmesinden oda sıcaklığında, adım 1.3 hazırlanan.
2. Bir doku ile temas kurutun ve MEA kurulumuna MEA monte edin.
   NOT: montaj sırasında nemli kültürünü korumak kültüre ekstrasellüler çözüm küçük bir damla ekleyin.
3. ekstrasellüler çözüm 300 ul ekleyin ve sistem stabilize etmek için izin vermek, kaydetmeden önce 10 dakika bekleyin.
4. kaydında basarak tüm elektrotlar 2 dakika süreyle kayıt spontan aktivite / yazılım butonuna kazanmak ve kayıt elektrotları tespit.
5. MEA elektrot stimülasyon: Uygun yazılım üzerinde uyarıcı genlik / süresini / şekli seçin ve ardışık olarak ¹³ açıklanan çeşitli elektrotlar için geçerlidir. (Adım 6.4 gibi) spontan aktivite gösteren olanlar dayalı elektrotlar seçin. Kalan tüm elektrotların Tutanak.
6. stimülasyon artefaktını dışlamak için, aynı elektrottan 10 kez uyarır. kültür 10 kez üzerinden en az 8 yanıt verirse, o kadar kabul edilebilirelektrot kaynaklı stimülasyon üzerine olumlu cevap.
7. arka plan gürültü tanımlamak için, 1 mcM cultureat bir konsantrasyon Tetrodotoxin (TTX) uygulamak 2 dakika süreyle voltaj bağımlı sodyum kanallarını ve kayıt engellemek için. başak algılama (7.1 ve 7.2) gerçekleştirmek için bunu kullanın.

7. Veri analizi

Not: Veri analizi ^daha önce ⁶ ve ^5'te detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan yazılım üzerinde ayrıntılarına için malzemeler Masa, nokta 7 bkz.

1. uygun yazılımı kullanarak standart sapma ve bir sonraki discriminator dayalı bir dedektör kullanılarak her elektrot için spontan aktivite tespit. Bu prosedür ^6'da tarif edilmektedir. Etkinlik hızlı gerilim geçişlerini (<5 msn) görünür.
2. sahte Ready arasında ayrım her bir deney için samples.Adapt eşik değerini tedavi TTX analiz ederken hiçbir aktivite ile sonuçlanan bir eşik seçinE ve yalancı negatif algılamaları.
3. Kullanarak uygun yazılım standart prosedürlere (- C Şekil 2A) göre bir raster arsa olarak her bir elektrodun tespit edilen nöronal aktivitenin gözlemlemek.
4. Belirleyin ve 1 msn adımlarla kaydırılır 10 msn kayar penceresi içinde algılanan tüm olayları, toplanarak toplam ağ etkinliğini gösterir.
5. uygun analiz yazılımı kullanarak ham verilerini görüntüleyerek uyarma kaynaklı aktivite tespit. çevrimdışı elle tek ani belirleyin. Tek sivri stimülasyon artifact (Şekil 2E ok başı) sonra meydana gelen, hızlı gerilim transientler görünür. Bir örneği Şekil 2E'de gösterilmektedir.
6. Deneye bağlı olarak, yanıt Elektrotların sayısı, bir yanıt elde etmek için gerekli bir eşik, elektrotlar ve ilgi ⁵ diğer parametreler her aksiyon potansiyelinin sayısı analiz eder.

8. Doku Fiksasyon ve Immunohistochemistry

NOT: boyama işlemi MEA yok edecektir. Reaktifler Malzeme Tablosu (nokta 4) Bkz.

1. Doğrudan kayıt sonra 37 ° C sıcak PBS üç kez kültürleri yıkayın. PBS atın ve 10 dakika boyunca 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA), uygulanır.
   UYARI: PFA zehirlidir. kurallarına göre uygun koruma ve atma solüsyonu ile kimyasal bir kaput çalışın.
2. PBS olan kültürler, üç kez yıkayın ve 2 saat süreyle PBS içinde% 2 sığır serum albümin (BSA) (% 0.01 Triton-X100) ile bloklayın.
3. İlk antikor PBS (% 2 BSA ve% 0.01 Triton-X100) içinde seyreltilmiş (Anti βIII tubulin, Tuj antikoru) ilave edin ve 4 ° C'de O / N bırakın. PBS kültür üç kez yıkayın.
   NOT: Şu anda ikincil floresan etiketli antikorun beyazlatma en aza indirmek için mümkün olduğunca sık karanlıkta örnek tutmak seçin.
4. PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor, ekleme (% 2 BSA, birD% 0.01 Triton-X100) ve oda sıcaklığında 1 ila 2 saat boyunca inkübe edilir. çekirdekleri 1 eklemek leke için: 10,000 DAPI (1 mg / ml stok), 10 dakika boyunca karıştırılır.
5. PBS ile üç kez yıkayın ve ince kapak fişleri geriye örnekleri montaj (24 x 50 mm ²⁾ montaj orta (Malzeme Tablo gelin 4) kullanılarak. 5X ve 20X büyütme ile bir floresan mikroskop kullanılarak görüntü.

Şekil 1 MEA doku izolasyonu, hazırlanması ve kültür prosedürü özetlemektedir. Biz Corti (OC) ve stria vaskularis (SV) organının duyusal epitelinden spiral ganglion (SG) izole etmek doku diseksiyonu ardışık adımları göstermektedir ve spiral ligament ekli (Şekil 1 A - C). Şematik Şekil 1D gösterilen ve elektrot işgal alanı (2.2 mm 2) üzerinde, MEA (Şekil 1E) üzerine yerleştirilmiş olarak spiral ganglion eksplantları (sayı 3-4) ganglion mikro-makas ile kesilir. OC elektrot yüzeyinin dışında, yakın yerleştirilir. Kültürünün büyüme süresi (Şekil 1G) üzerinden takip edilebilir. Protokolün bir şematik diyagramıdır Şekil 1F gösterilmiştir. Elektrofizyolojik aktivitesi uzamış kültür süresi ile artar 6 günlük bir kültürden sonra tespit edilebilir. Bizecommend erken zaman noktalarında 5 ile karşılaştırıldığında kayıt elektrotları önemli ölçüde daha yüksek sayıda üreten 18 gün kültürleri değerlendirirken.

Şekil 1. Hücre kültürü hazırlanması. (A) Taze fare iç kulak disseke. Beyaz çizgi Kokleanın yeri, siyah kesikli çizgi vestibüler bölgesini gösterir gösterir kesik. Koklear kemik duvarının çıkarılmasından sonra (b), fare iç kulak. Koklear döner beyaz kesik çizgilerle gösterilmiştir. (C) Spiral ganglion (SG) ve modiolus, Corti (OC) ve stria vaskularis (SV) ve spiral ligament organ diseksiyonu sonra gösterilmektedir. (D) SG ve OC diseksiyonu ve SG eksplant hazırlanması {yayıncı onayı ile 5 uyarlanan rakam} şematik. Bu çalışmada kullanılan çoklu elektrot dizisinin (E) Çizim. recodingelektrotlar merkezinde dikdörtgen bir ızgara düzenlenen ve 2,2 mm 2 lik bir alanı işgal edilir. 4 Zemin elektrotlar ve yan kontakları gösterilmektedir. Kültür protokolü (F) şematik. Kayıtlar gün 18. (G) Temsilcisi resimler (parlak bir alan görüntüler) ve 1 gün, 6 ve 18. Ölçek çubukları = 400 mikron kültürde izlenen MEA SG eksplant planları yapılmaktadır. Büyük halini görmek için tıklayınız bu figür.

Spontan aktivite MEA tespit ve arsa her satırı bir tespit başak temsil eden bir raster arsa olarak gösterilebilir. (Grafiklerde farklı renklerde) birçok elektrodlardan tespit spontan aktivite gösteren temsili bir örneği, (Şekil 2A, 2B ve 2C) de gösterilmiştir.

(Şekil 2D), stimülasyon için kullanılan bir iki fazlı vurum gösteren temsili bir örneği, 5 yanıt elektrotlar (kırmızı izleri) ve non-yanıt elektrotlar (mavi izleri) Şekil 2E'de gösterilmektedir. Bu deneyler için bir elektrot uyarılması ve kayıt için tüm diğer elektrot kullanılmıştır. Tek aksiyon potansiyelleri stimülasyon artifact (siyah ok başı) sonra 1 msn ortaya çıktı. MEA elektrot alanı üzerinde nöron kapsamını değerlendirmek için prosedürün sonunda boyanmış olabilir. Şekil 2F'de, yeşil belirtilen elektrot uyarılması için kullanılmıştır ve kırmızı belirtilen elektrotlar yanıt (Şekil 2E) kaydetmek için kullanılmıştır.

MEA Şekil 2. Veri kayıtları. (A </ Strong>) spontan aktivite gösteren altı 63 üzerinden elektrotlar orijinal kayıtların izleri. Başak algılama sonra Şekil 2A altı elektrotlar (B) Raster arsa. Her çubuk bir aksiyon potansiyeli temsil etmektedir. Elektrotlar faaliyeti (A ve B) de dahil olmak üzere (C) Tarama arsa 2 dakika boyunca 63 elektrotlar (kanal numarası 0-63) için kaydedilir. (D) toplam 80 mikro-saniye süresine ve 80 uA genliği ile bir iki fazlı uyarı için tek bir elektrot (Şekil 2F'de E58) kültür uyarılması için kullanılmıştır. (E) ya da uyarılmasından sonra yanıtları (mavi izleri olmadan) elektrodun aksiyon potansiyelleri (kırmızı izleri) gösteren 58 uyarıldıktan sonra elde edilen ham veri izleri Temsilcisi örneği (siyah ok kafalı). Nöro görselleştirmek için deney sonunda (F) nöronal belirteç Tuj (yeşil) immunohistokimyasal MEA Spiral ganglion kültürü elektrot alanının nal kapsama {figure yayıncı onayı ile 5 uyarlanmıştır}. uyarılması için kullanılan elektrot 58 yeşil gösterilir yanıt elektrotlar kırmızı ile gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Son olarak, MEA kurulum kayıt hassasiyetini artırabilir olası elektrot yüzey modifikasyonu incelemek için izin verir. 150 nm kalınlığında bir Pt tabakası (empedansı: 400 kH / 1 KHz) 'den oluşan, Gri Platinyum (Gri Pt): iki ticari olarak temin edilebilir MEA elektrotlar, iki farklı platin yüzeyi ile bu çalışmada kullanılmıştır ve siyah Platin (siyah, Pt), mikro üretim süreci (20 kH / 1 KHz empedansı) sonunda Pt elektrokimyasal birikmesi ile elde edilmiştir. Ayrıntılar için malzemeler Tablosu (madde 6) Bkz.

Siyah Pt elektrotlar vs Grey 3. Karşılaştırılması Şekil. İki elektrot tipleri (Gri ve Siyah Pt) 12 bağımsız MEA kültürleri, her MEA tipine 6 kullanarak yan yana karşılaştırıldı. (A) re toplam sayısıDeneme başına sponding elektrotlar gösterilir. 6 bağımsız MEA deneylerinde 30-35 bağımsız elektrot çiftleri kullanılarak ölçüldü (B) bir yanıt ortaya çıkarmak için amplitüd eşik gösterilmiştir. Veriler ortalama +/- SD olarak gösterilmiştir. (Student t testi p <0.001) , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.