Pedunculopontine Nucleus Nöronlar Kayıt Gama Bant Salınımlılığı

PPN çekirdeği anatomik kaudal Mezensefalik tegmentumdaki dahildir. PPN RAS ¹ önemli bir bileşenidir. PPN (uyanma, REM uykusu yani) ² davranışsal aktif devletlerin bakım katılır. Sıçan bilateral PPN lezyonların azalır veya REM uykusunu ⁴ elimine ederken, kortikal EEG ³ - (40 Hz 20) in vivo PPN'nin elektrik stimülasyonu hızlı salınım kaynaklı. PPN nöronların çoğunluğu beta / gama-bant frekansı aksiyon potansiyelleri ateş ederken (20-80 Hz), bazı nöronlar spontan ateşleme düşük oranlar sundu (<10 Hz) ^5. Ayrıca, PPN gibi motivasyon ve dikkat ⁶ gibi davranış diğer yönleri dahil olmak görünüyor. Doğrudan yüksek frekans (40 - 60 Hz) deserebre hayvanlarda PPN çekirdeğinin ⁷ elektrik stimülasyonu hareketlilik teşvik edebilir. Son yıllarda, derin beyin stimülasyonu (DBS) PPN'nin sağa sola şikayet eden hastaları tedavi etmek için kullanılır olmuşturParkinson hastalığı (PH) ⁸ olarak yürüyüş açıkları kapsayan m bozukluklar.

Önceki raporlar kare akım darbeleri ⁹ kullanılarak depolarize zaman neredeyse tüm PPN nöronlar gamma bant frekansı aksiyon potansiyelleri ateş göstermiştir. Çünkü mV kadar veya -25 altında kare bakliyat depolarizasyonlarından sırasında voltaj bağımlı potasyum kanallarının şiddetli aktivasyon. Bunun bir sonucu olarak, herhangi bir güçlü gama salınımlar Tetrodotoksin ¹⁰ kullanılarak aksiyon potansiyelleri nesil engelleme sonra gözlenmiştir. Böyle bir sorun atlamak için bir çaba, 1 - uzun cari rampaları depolarizan 2 sn kullanıldı. Kısmen voltaj bağımlı potasyum kanallarını inaktive ederken Rampaları yavaş yavaş, 0 mV kadar değerleri istirahat membran potansiyeli depolarize. Net gama bandı membran salınımlar ¹⁰ (-25 mV ve -0 mV arasında, yani) yüksek eşik kalsiyum kanallarının voltaj bağımlılığı penceresi içinde belirgindi. Sonuç olarak, gama bandı olduğu faaliyetlerty PPN nöronlar ⁹ gözlendi ve her iki P / Q ve N-tipi voltaj bağımlı kalsiyum kanalları PPN ¹⁰ gama bant salınımları oluşturmak amacıyla aktive edilmesi gerekir.

bir dizi çalışma PPN nöronlarda yüksek eşik kalsiyum kanallarının yerini tespit edilmiştir. Boyaların kombinasyonunu enjekte oranlı metrik floresan görüntüleme geçerli rampalar ¹¹ ile depolarize zaman farklı dendritler aktive edilir voltaj kapılı kalsiyum kanalları aracılığıyla geçici kalsiyum gösterdi.

PPN nöronların içsel özellikleri dolayısıyla RAS ve talamokortikal döngüler arasında yüksek frekanslı titreşimli nöronal aktiviteyi uyaran, uyanma ve REM uykusu sırasında bu hücrelerin simultane aktivasyonu izin öne sürülmüştür. Bu tür uzun erimli bir etkileşim güvenilir bir şekilde sürekli olarak ¹² etrafımızdaki dünya değerlendirebilecek bir beyin durumunu desteklemek için kabul edilir. Burada, biz denemeyi tarifGerekli al koşulları oluşturmak ve in vitro PPN hücrelerinde gama bandı salınımını korumak için. Bu protokol daha önce tarif edilmemiştir, ve diğer beyin alanlarında gama bandı aktivitesini aracılık içsel membran özelliklerini incelemek için grupların bir dizi yardımcı olacaktır. Ayrıca, mevcut adım y bandı aktivitesi bu hücrelerde üretilen edilemez hatalı sonuca yol açabilir.

Tüm deneysel protokoller Arkansas Tıbbi Bilimler Üniversitesi (Protokol numarası # 3593) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımına ilişkin Sağlık kılavuzların National Institutes ile anlaşma idi.

Standart yapay beyin omurilik sıvısının hazırlanması 1. (CSF)

1. Stok Çözeltisi A Hazırlanması
   1. kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L'lik bir kap için distile su, 700 ml ilave edilir.
   2. Sürekli 500 ml bir hacme karıştırılırken, NaCI 136,75 g KCI 6.99 g, MgSO ₄ 2.89 g, ve NaH ₂ PO ₄ 2.83 g ekleyin.
   3. Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 117 mM NaCI, 4.69 mM KCI olduğu, 1.2 ila ₄ mm MgSO, ve 1.18 mM NaH ₂ PO _4.
   4. 2 hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında tutun.
2. Stok Çözeltisi B'nin Hazırlanması
   1. kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L çanağa damıtılmış 700 ml su ekleyin.
   2. Sürekli 500 ml bir hacme karıştırılırken, D-glukoz 41.45 g NaHCO ₃ 41.84 g ekleyin.
   3. Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 11.5 mM D-glikoz ve 24.9 mM NaHCO _3'tür.
   4. 2 hafta boyunca 4 ° C'de buzdolabında tutun.
   5. Her deney karışımı önce 50 50 ml stok B ile stok ml sürekli karbojen (-% 5 _CO2 karışımı% 95 O ₂₎ ile oksijene ederken nihai konsantrasyon aCSF solüsyon elde etmek ve oda sıcaklığında bırakın damıtılmış su ile 1 L'ye getir en az 30 dakika karıştırıldı. Sadece her bir deney başında nihai konsantrasyon aCSF hazırlayın ve günün sonunda atın.

Sakkaroz-yapay beyin omurilik sıvısının 2. Hazırlık(Sakroz-CSF)

1. Stok Çözeltisi C hazırlanması
   1. kimyasal ilave edilmeden önce, temiz bir 1 L'lik bir kap için distile su, 700 ml ilave edilir.
   2. Sürekli damıtık su 500 mi karıştırılırken, sükroz, 240 g, NaHCO ₃ 6.55 g, KCI 0.671 g, _MgCl2 4.88 g, _CaCI2 0.22 g askorbik asit, 0.21 g ekleyin.
   3. Seyreltildikten sonra 1 L bir son hacme ulaşmak için daha fazla damıtılmış su ekleyin, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 701,1 mM sakaroz, 78 mM NaHCO _3, 9 mM KCI, 24 mM _MgCl2, 1.5 mM _CaCl2 ve 1.2 mM askorbik asit .
   4. en fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de stok çözeltisi C tutun.
   5. Her deney karışımı önce sürekli bir karbojen (% 95 O _{2-5% CO2} karışımı) ile oksijene ise son konsantrasyonda sukroz-CSF çözelti elde etmek ve oda sıcaklığında bırakın distile su, 600 ml stok C, 50 ml, 300 mi en az 30 dakika karıştırıldı.

   3. Dilim Hazırlık

   1. karbojen ile oksijene, buz içinde 100 mi sükroz aCSF çözeltisi ile temiz bir beher yerleştirilir ve 0.1 M NaOH solüsyonu birkaç damla eklenirken bir pH metre kullanılarak 7.4 pH düzeltme (zaman pH <7.4) ya da 0.1 M HCI çözeltisi ( pH> 7.4).
   2. sakaroz-aCSF ile bir vibratome bir kesim odasına kadar doldurun ve oksijen. Kesme odasına bağlanmış gliserol tabanlı soğutma sistemi açın ve 0 kadar soğuması için 15 dakika bekleyin - 4 ° C.
   3. (; <50 ul son hacim ile 70 mg / kg, ip), Ketamin ile (yetişkin Zamanlı gebe Sprague-Dawley fareleri ile 12 yaş 9) yavrular anestezisi. yavru sakin olduğunda, çift o kuyruk tutam refleks yoktur edin.
   4. yavrular başını kesmek.
      1. Bir karbonlu çelik neşter bıçak kullanarak geri ve forseps kullanarak yanlara cilt çekin önden uzunlamasına kafa cildi kesin. sc hareketli beyini çevreleyen kemik kesmekyanal issors ve tamamen beyin açığa çıkarın.
      2. Sonra hızla (başlangıçta hafifçe en kaudal alanlara doğru en rostral beyni dışarı itmek için koku ampul altına) bir spatula kullanarak beyin kaldırmak. Yavaşça buzla soğutulmuş oksijenli sükroz yapay beyin omurilik sıvısı (sükroz-CSF) içine beyin itin.
   5. (Yarımkürede yaklaşık üçte birini öldürmesi) sağ hemisfer bir parasagital kesim olun ve manyetik içeren sagital 400 mikron bölümleri kesmek için bir vibroslicer kesme odasına sabit olacak bir metalik diske beynin kesilmiş tarafını tutkal pedunculopontine çekirdeği (PPN). bütün hücre patch-clamp kayıtları önce 45 dakika boyunca oda sıcaklığında PPN dilimleri tutun.

   PPN Dilimleri 4. Kayıtlar Gamma-bant Salınımlılığı

   1. Potasyum glukonat hücre içi Çözüm hazırlanması (High-K ⁺ Çözümü)
      1. Yerleştirmekdistile su 10 ml ile temiz bir beher buz. K ⁺ -gluconate, 90,68 mg phosphocreatine di Tris tuz, 47.66 mg HEPES, 1.5 mg EGTA, 40.58 mg Mg ²⁺ ATP ve 4 mg Na ⁺ ₂ -GTP: Sürekli eklemek karıştırırken.
      2. KOH 7.3 (damıtılmış su içinde 100 mM), pH ayarlama. 20 mL'lik bir son hacme ulaşmak için saf su ekle. 290 mOsm - gerekli olduğunda, 280 olarak sakaroz (damıtılmış su içinde 100 mM) ile, ozmolarite ayarlayın. Seyreltildikten sonra, her bir bileşiğin nihai konsantrasyon 124 mM K ⁺ -gluconate olan, 10 mM fosfokreatin di Tris tuzu, 10 mM HEPES, 0.2 mM EGTA, 4 mM Mg2 ⁺ -ATP ve 0.3 ^mM, Na ⁺ ₂ -GTP.
      3. Kısım hücre 1 ml tüpler çözeltiler ve dondurularak -20 ° C'de ilave edildi. günde bir kısım kullanın ve deneyler süresince 4 ° C'de tutun.
   2. Tüm hücre yama Kelepçe Kayıtlar
      1. bir daldırma bölmesi dilimleri yerleştirin ve oksijenli ile (1.5 mL / dakika) ile perfüze(% 95 _O2 - _CO2,% 5), aşağıdaki reseptör antagonistlerini içeren CSF: Selektif NMDA reseptör antagonisti, bir 2-amino-5-phosphonovaleric asit (APV, 40 uM), rekabetçi AMP A / kainat bir glutamat reseptör antagonisti 6-siyano-7- nitrokuinoksalin-2,3-dion (CNQX, 10 uM), glisin reseptör antagonisti striknin (STR, 10 uM), belirli bir GABA _A reseptör antagonisti gabazine (GBZ, 10 uM) ve sodyum kanal bloke tetrodoksin (TTX 3μM)
         NOT: sonuçlar ve rakamlar, bu antagonistleri toplu olarak sinaptik bloker veya SBs adlandırılır.
      2. Kayıt yama pipetler dolgu, bir ticari olarak elde edilebilen parça pipet dolgu maddeleri kullanılarak hücre içi yüksek K ⁺ çözeltisi (Direnç 2-7 MQ 1,0 mm dış çapı ve 0.6 mm iç çap normal, ticari olarak temin edilebilir kalın duvarlı borosilikat cam kılcal yapılmış) çözelti filtre. onun amplifikatörün tutucu pipet yerleştirin. Küçük bir pos uygulaBir üç yollu vanaya bağlı bir silikon tüp kullanılarak pipet sahibine bağlı 1 ml'lik şırınga ile gösterilmiş pozitif basıncı. Bir yama kelepçe amplifikatör pipet tutucu arka bağlayın.
      3. yakın kızılötesi diferansiyel girişim kontrast optik kombine bir 4X objektif kullanılarak PPN çekirdeğe yakın bir mekanik mikromanipülatör kullanarak kayıt pipet hareket ettirin.
         NOT: PPN çekirdeği superior serebellar sapı ile dilimler dorsal görülebilir (SCP; akson kalın bir paket olarak gözlemlenebilir). Kayıt pipetler PPN'nin yerleşmişti sapı arka ucuna dorsal hemen bulunduğu compactadaki, pars.
      4. 40X suya daldırma lens kullanarak görüntülenmiştir iken PPN nöron ile temas halinde kayıt pipet getirin ve hızla hücre ile bir mühür formu negatif emiş uygulanır.
      5. Üreticinin protokolü kullanılarak negatif emme sırasında pipet direnci izlemek için gerilim kelepçe mühür yazılımını kullanın.
         1. Ne zaman olumsuz suction yavaş yavaş artar ve pipet ucu yama-kelepçe monitör tarafından okuma direnç değerleri 80 ulaşır - hızla mV -50 ve negatif basınç serbest tutma potansiyeli değiştirmek, 100 Mohm. Sürekli nöronun membran ve elektrik ile erişim tam hücre konfigürasyonunda elde edilir yırtılma girene kadar, emme uygulamak başlayın.
         2. gerilim kelepçe mühür yazılımı ile ölçülen erişim direnç değerleri 10 MOhm veya daha yüksek ise, o zaman küçük miktarlarda negatif emme uygulayarak devam edin.
      6. Kapasitans telafi gerilim kelepçe modunda ve seri direnç (yani, yavaş ve hızlı geçici hücrenin zarı kırılması sonra gözlenen). Köprü değerleri telafi hızla geçerli kelepçe kayıt moduna geçmek ve (örneğin, amplifikatör düğmesini taşımak veya computer's fareyi kullanarak otomatik kompanzasyon menüsünü tıklayın).
         1. PPN nöronun sürekli dinlenme monitörü zar potansiyeli u kaydediliyorüreticinin protokolünü şarkı. depolarizan veya hiperpolarizan değerlere doğru membran potansiyeli kayması istirahat, daha sonra optimum -50 mV nihai değerini tutmak için doğru akım (100 pA kadar) küçük miktarlarda kullanın.
            NOT: -48 mV istikrarlı istirahat membran potansiyeli (RMP) veya daha fazla hiperpolarize (yani, RMP <-48 mV) ile sadece PPN nöronlar tutun.

Başlangıçta, gama salınımlar kare akım darbeleri kullanarak uyarılmış bulundu. Sinaptik bloker ve TTX huzurunda PPN nöronların Güncel kelepçe kayıt sürekli istirahat membran potansiyeli ~ -50 mV (Şekil 1A) istikrarlı tutuldu sağlamak için izlenmiştir. İki saniyelik kare akım darbeleri 200 Pa ila 600 Pa (Şekil 1A) genliği artan kayıt pipet ile yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte edilmiştir. Membran potansiyeli -20 mV yakın gerilim seviyelerine depolarize zaman 600 pA, küçük genlikli gama salınımları ile sonuçlanır. Gama salınımlarının Yetkileri spektrumları çok küçük genlikli değerlerini sundu (yani <0.01; Şekil 1B). Öte yandan, iki adet ikinci depolarizasyon akımı rampalar sağlam y titreşimler üretmek kayıt pipet ile yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte edilmiştirDaha yüksek bir güç amplitüdleri sunulmaktadır (Şekil 2A) (Şekil 2B).

Önceki çalışma 10 meydanda arasındaki farkları bağlantılı ve eski ani depolarizasyon sırasında voltaj bağımlı potasyum kanallarının dize aktivasyonuna mevcut protokolleri rampa vardır. Yavaş depolarizan rampaları yerine potasyum kanallarını inaktive olabilir.

Tüm hücre Şekil 1. Membran Titreşimler Genlik Artırılması Güncel Meydanı Bakliyat kullanarak PPN Nöronlar kaydedildi. Sinaptik bloker ve TTX varlığında, kayıt pipet aracılığıyla yama kelepçe amplifikatör tarafından hücre enjekte artan genlik 2 sn uzun kare adımlar depolarizan (A) Temsilcisi membran potansiyeli yanıtları. (B) Çakışandepolarizan adımlarla tarafından oluşturulan 60 Hz bant geçiren filtreleme salınımları - A.Gücü spektrumları gösterilen kare darbeleri kullanılarak elde edilen salınımlar için güç spektrumu amplitüdleri 20 sonra Hamming pencere fonksiyonu kullanılarak elde edilmiştir. PPN nöron yüksek K + hücre içi çözüm ve TTX Protokolde tanımlanan sinaptik bloker + birleştirerek akım kelepçe konfigürasyonunda kaydedildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tüm-hücrede Şekil 2. Gama Band Membran Titreşimler artırmada Genlik Güncel Rampaları kullanarak PPN Nöronlar kaydedildi. Hücre kayıt pipet, gösterisi ile yama kelepçe amplifikatör tarafından enjekte 2 sn uzun rampalar depolarizan (A) Temsilcisi membran potansiyeli yanıtları60 Hz bant geçiren filtreleme salınımlar depolarizan rampa tarafından oluşturulan -. 20 sonra sinaptik bloker ve TTX varlığında genlik artan ing (B) A. Gücü spektrumları gösterilen rampaları kullanılarak elde salınımlar için güç spektrumu genlikleri Çakışan bir Hamming pencere fonksiyonu kullanılarak elde edilmiştir . PPN nöron yüksek K + hücre içi çözüm ve TTX Protokolde tanımlanan sinaptik bloker + birleştirerek akım kelepçe konfigürasyonunda kaydedildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.