Domuz Tibial Allotransplantation cerrahi angiogenez: bileşik Allotransplantation Model yeni bir büyük hayvan kemik skarların

Büyük segmental kemik defektleri sonucu travma, enfeksiyon veya uzuv sparing cerrahi malignite sonra. Geçerli Rekonstrüktif seçenekleri bozukluklarına otojen kemik grefti, kemik aktarımı, protez değiştirme ve cryopreserved nekrotik allogrefler gibi tek başına kullanılan veya birlikte, önemli morbidite ile ilişkili olan ve yüksek oranda var komplikasyonlar^1,2,3.

Mikrovasküler ağ varlığı oluşumu ve homeostasis kemik, Osteojenik destekleyen, chondrogenic ve Mezenkimal kök hücrelerin kemik onarım⁴için gerekli gereklidir.

Yaşam allojenik kemik, onun besin Transpediküler mikrocerrahi anastomoz ile gerçekleştirilen bozukluklarına kompozit doku allotransplantation (kemik VCA), bir tür nakli gelecekteki bir Rekonstrüktif alternatif temsil edebilir. Cryopreserved allojenik kemik gibi yakından Kemik defekti Morfoloji eşleştirerek hemen istikrar sağlanmıştır. Gelişmiş şifa ve yaşam remodeling sağladığı gibi otojen greft bozukluklarına, kemik doku. Herhangi bir allotransplant yordamdaki engel uzun-vadeli-immünosupresyon (IS) ihtiyaç kalmıştı. Uyuşturucu doz 2 - 3 kere⁵organ nakilleri daha büyük gerektiren kas-iskelet dokularda daha ciddi bir sorundur. Eşlik eden riskleri organ toksisite, malignite, enfeksiyon veya graft - versus - host hastalığı gelişimi de dahil olmak üzere bu nonlife kritik uygulamalar⁶' haklı zordur. Ancak, akut ve kronik ret bölümlerini geçerli uzun vadeli IS⁷ile önemli bir sorun olarak kalır. Yakından MHC antijenleri maç, donör özgü tolerans ikna etmek ve/veya uyuşturucu immünoterapi geliştirmek için sürekli çaba değil henüz düzenli olarak başarılı klinik uyuşturucu ücretsiz doku hayatta kalma^8,9erişimine izin verme.

Biz daha önce kemik VCA canlılığı korumak ve Transplante kemik içinde yeni bir otojen dolaşımını teşvik tarafından küçük hayvan modellerinde remodeling kemik geliştirmek için yol gösterdi. Bu implant otojen doku^10,11,12den cerrahi angiogenez ek kullanımı ile yapılır. Allojenik kemik parçaları microsurgically besin kemik segment Transpediküler anastomoz ile nakledilmektedir. Ayrıca ana bilgisayar kaynaklı damarları allojeneik bozukluklarına kemik parçasının medüller kanal implante edilir. Bu 2 haftalık süreçte a_ılabilinirse allojeneik besin geminin uyuşturucu immünosupresyon ile korunur. Is-çekilme sonra besin Transpediküler sonunda thrombose¹³olacaktır. Ana bilgisayar kaynaklı damarları dayalı yeni kapiller yatak doku canlılığı korumak için yeterli kan dolaşımı sağlar. Şifa ve remodeling kemik osteogenesis beri geliştirilmiştir ve anjiogenezi eşleşmiş^10,11,12vardır. Yok daha da immünoterapi gereklidir ve kemik canlılığı uzun vadeli bir immunologically yetkili ana bilgisayar ve donör özgü tolerans yokluğu rağmen korunur.

Çeviri kemik allotransplantation klinik uygulamaya bu yeni yöntemin en iyi şifa, mekanik özellikleri ve İmmünoloji büyük bir hayvan modelinde daha fazla çalışma tarafından öncesinde. Domuz modeli böyle VCA araştırma^14,15,16için idealdir. Minyatür domuz iskelet imar temelde aynı cerrahi implantlar ve teknikleri kullanarak sağlayan adam için boyutu ve anatomi karşılaştırılabilir. Domuz İmmünoloji iyi tanımlanmış domuz lökosit antijen (SLA) haplotypes ve kan nakli ameliyatı için gereken türler de dahil olmak üzere. Detaylı analizler bağışıklık yanıtı^{17,18,19,20,21}olarak hücre lineage çalışmalar seks eşleşmeyen nakli ile mümkün vardır.

Burada, Yucatan minyatür domuz, gelen bir segmental kemik kaybı ve yeniden yapılanma çalışması için uygun bir kemik VCA allotransplantation modelinde açıklayın. Bu model cerrahi angiogenez etkileşimi araştırmak için kullanılabilir ve kısa vadeli IS üzerinde kemik VCA hayatta kalma ve fonksiyonu, osteocyte soy, dahil olmak üzere kan akımı, şifa ve kapasiteleri, alloresponsiveness ve biyomekanik olarak için de remodeling kemik diğer yenilikçi immün düzenleyici stratejileri test.

Çalışma kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Mayo Clinic Rochester tarafından kabul edildi. Yucatan minyatür domuz bağış ve alıcıların bu VCA ameliyat sırasında hizmet. Donör ve alıcı eşleştirme SLA ^22,23yılında büyük bir uyumsuzluk emin olmak için DNA dizisi domuz lökosit antijen (SLA) haplotyping üzerine dayanıyordu. Hayvanlar ve aynı kan grubu yaş ve ağırlığı eşleştirdi. İki cerrahi ekip aynı anda bir domuz tibial kemik kesimi donörden besin onun gemi ile hasat ve alıcının allojeneik tibial kemik orthopically yerleştirilen parça almak için hazır. Aynı anda ile mikrovasküler onarım kemik besin geminin otojen angiogenez için tibial segmentteki bir alıcı kaynaklı arteriyovenöz bohça yerleştirildi.

1. presurgical hazırlıkları

1. Yucatan minyatür domuz gün önce yordamı hızlı ve kontrollü ilaç idaresi için tartmak.
2. Subkutan uygulandı kullanan kişi hayvanlar Xylazine (2 mg/kg) ve tiletamine HCL ve zolazepam HCL (5 mg/kg) kombinasyonu ile.
3. İntravenöz ilaç ve serum fizyolojik teslimat için bir kulak ven periferik bir kateter yerleştirin ve buprenorfin (0,18 mg/kg) ve profilaktik antibiyotik (1 g cefazoline Intravenous ve 5 mg/kg ceftiofur kas içi) yönetmek.
4. Doğru hindlimb ve hasat site bozukluklarına tibial kemik segment ve merkezi Venöz kateter yerleştirilmesi için site için sırasıyla görevi görecek sol boyun tıraş.
5. Hayati belirtileri ve sedasyon düzeyi ağız kas gevşeme test ederek kontrol edin.
6. Sternal recumbency²⁴uygun ölçekli bir endotrakeal tüpte hayvanla Tüp takacağım.
7. Minyatür domuz işlem tablosuna transfer ve Solunum makinesine anestezi açısından isoflurane (1-%3) yönetmek olarak bağlanın.
8. Anestezi derinliği palpebral, gözbebeği ışık ve kornea refleksleri test ederek onaylayın.
9. Kulağa bağlı bir nabız oksimetre iletim sonda ile oksijen doygunluğu izlemek. Kan basıncı manşet ve sıcaklık probu intraoperatif hayati işareti izlemek için kullanın.
10. Yucatan minyatür domuz ısınma bir yastık üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Ayrıca, zorla-hava ısınma battaniye işlem sırasında hipotermi engellemek için kullanın.
11. Veteriner merhem gözünü kuruluk anestezi iken altında engellemek için kullanın.

2. hasat bir bozukluklarına Tibial kemik parçasının

1. Sağ bacak her minyatür domuz povidone-iyot solüsyonu ile yıkayın. Steril bir havlu ile cilt kuru ve ekstremite steril bir biçimde asmak. Örtmek ve bulaşma riskini en aza indirmek için bir iyot emdirilmiş yapışkanlı kesi örtüsü ile bacak yalıtır.
2. Bir kesi ile bir neşter anterolaterally klemple tibiotalar eklem tibia ön sırt boyunca uzanan diz eklemi başlayan hindlimb, gerçekleştirin.
3. Deri ve subkutan doku makasla teşrih ve ön bölme kasları tibia dan yanal geri çek.
   Not: Yayın tibialis anterior kas kökenli pozlama kolaylaştırır. İnterosseöz membran şimdi maruz kalmaktadır.
4. Kafatası tibial arter tanımlamak ve (daha sonra arteriyovenöz paket cerrahi angiogenez için kullanılmak üzere) damar.
   Not: Kafatası tibial arter ve ven interosseöz membran ön yüzeyinde yalan.
5. Operatif görüş alanı artırmak için onun ekleme gelen tibial ön kas bir bölümünden yayın ve tibial ridge bir parçası salınan bir testere kullanarak kaldırın.
6. Kafatası tibial gemileri korumak, bir makas ile tibial tubercle düzeyini interosseöz membran başında deşmek.
7. Klemple membran altında çalışan Kaudal tibial gemiler, gözünde canlandır.
   Not: Onlar kafatası tibial gemileri şube ve tibial diaphysis tubercle için sadece distal besin Transpediküler ortaya çıkmasına. Şimdi besin deliği ve tibial tubercle arka lateral yüzeyi sadece distal tibia girerek damarları görselleştirmek mümkündür.
8. Bir microclamp ile besin Transpediküler etiketleyin. Vasküler Transpediküler ayırmaz.
9. Bir kas şube besin deliği yakınındaki anterior tibial bölmesinde tanımlamak; Bu bozukluklarına kemik allotransplant besin gemisine anastomoz için kullanılabilir. Kas dalı bir microclamp ile işaretleyin.
10. Vasküler Transpediküler dahil olmak üzere bir 3,5 cm tibial kemik parçasının hasat.
    1. Bir kesme jig kesin ve tekrarlanabilir kemik rezeksiyonu emin olmak için kullanın. Konumu ve düzeltme kesme besin deliği ve gemiler dahil etmek için tibia medial yüzeye jig.
       1. Jig tarafından yönlendirilen, paralel kemik keser bir 3,5 cm tibial kesimi kaldırmak için salınan bir testereyle gerçekleştirin. Aynı konumlandırma ve jig donör ve alıcı hayvanlar için boyut ve şekil eşleştirme en üst düzeye çıkarmak için kullanın.
11. Her iki kesim ile salınan testerenin yapıldıktan sonra tibial kemik parçasının arka yüzeyi besin Transpediküler görselleştirmek döndürün. Kafatası tibial arter üzerinden Aslına, besin Transpediküler makasla bölün. İncelemek ve makas ile kesme yüzeyinde ince bir manşet kas ve kapaklarini bırakarak, tibial segment ücretsiz.
12. Tibial kemik segment geri çekmek ve kafatası tibial arter yerinde bırakarak keskin bir kelepçe ile onun vasküler Transpediküler tibial kemik segment yükseltmek.
    Not: Şimdi bozukluklarına kemik segment mikrovasküler nakil için hazır ve bir 3.5 cm tibial Kemik defekti her Yucatan minyatür domuz oluşturuldu.
13. Kafatası tibial damarları absorbe polyglactin ayak bileğine, 3-0 dikişler, onları Perivasküler doku arteriyovenöz (AV) paket oluşturmak için bir manşet ile serbest ligate. Dikiş en az 5 cm uzunluğunda hafifletmek implantasyonu tibial kemik segment içine bırakın.

3. Orthotopic Tibial kemik VCA imar cerrahi angiogenez ile birlikte

1. Onları VCAs kemik gibi kullanmak için iki hayvan arasında onun besin vertebral ile hasat tibial kemik parçaları değiş tokuş.
   1. Kafatası tibial arteriyovenöz (AV) paket geçiş tibial kemik segmentine izin için salınan testerenin kullanarak proksimal kavşak sitesi segmentten şeklinde V kaldırın.
   2. Distal kesiminde tibial Kemik defekti site ve tibial kemik parçasının medüller kanal içine 0.5 cm çapında bir delik delme ve sonraki teşvik etmek intramedullary kanala klemple, bakmaksızın alıcı AV paket tanıtmak otojen yeni kan akımı.
2. Bozukluklarına tibial kemik segment orthotopically alıcı defekt yerleştirin.
   1. Besin Transpediküler tibial ön bölmenin basit kesintiye uğramış dikiş tekniği ve 9-0 dikişler²⁵bir bitiş için son şekilde kullanılarak hazırlanan kas dalı tibial kemik parçasının anastomose.
3. Sağım test²⁶kullanarak mikrovasküler anastomoz a_ılabilinirse onaylayın.
4. Karşılaştırılan bir 9 delikli 3.5 tabağı kilitleme mm kullanarak elde.
   1. 9 delikli plaka üzerinde tibia anteromedially yerleştirin. Plaka üzerinde ve tibial kemik segment altında üç bicortical vida ile düzeltmek. Ayrıca, internal fiksasyon için tibial kemik kesim unicortical vidaları yerleştirin. Onaylamak için doğru kemiğin konumlandırma VCA ve plaka, kullanın hastanın ve yanal ilerlemenin.
5. FASİAL gerçekleştirmek ve katmanlı cilt kapatma kullanarak 3-0 ve 2-0 absorbe dikiş kesildi. Sonunda bir tıkayıcı şeffaf soyunma yarayla kapatın.

4. Merkezi Venöz kateter yerleştirme Şah dış ven

1. Ameliyat sonrası ilaç idaresi ve immünsupresif (IS) uyuşturucu düzey izleme için bir Venöz kateter açık bir tekniği kullanarak dış juguler ven yerleştirin. Yerleştirme anestezi (bakınız Bölüm 1) altında allotransplantation yordamının sonuç olarak gerçekleştirin.
   1. Anterolateral kesik bir neşter ile boyun gerçekleştirin. Subkutan doku makasla teşrih ve sol juguler ven bulaşmasına neden.
   2. Dış juguler ven içinde küçük bir delikten juguler ven Hickman kateteri yerleştirin ve absorbe olmayan dikiş ile sabitleyin. Arkadaki kateter subkutan tünel oluşturarak exteriorize.
   3. Kateter yerde cilt için güvenli ve yakın 3-0 ve 2-0 absorbe dikiş kullanarak katmanları boynundan kesildi.
   4. Tıkayıcı bandaj kesi yerleştirin. Bir File bandaj bandaj ve kateter tutmak için kullanın.

5. Postoperatif tedavi ve takip

1. Ameliyattan hemen sonra Yucatan minyatür domuz carprofen (4 mg/kg) ameliyat sonrası analjezi için bir kas içi enjeksiyon ile tedavi. Gerektiği gibi yüksek şiddette ağrı tedavisinde buprenorfin (0,18 mg/kg) yönetmek için.
2. Domuz 60 dk için yeniden elde etmek ve daha sonra domuz özel yoğun bakım ünitesi pan ve monitör yakından kadar tam kurtarma dönmek izin.
3. Yucatan minyatür domuz için normal bir kafes ve ad libitum erişebilmesi için su ve yiyecek taşımak.
4. Kafesi yönetmek (0,8-1.5 mg/kg/gün) ve mycophenolate mofetil (MMF) (50-70 mg/kg/gün) sözlü olarak ve Metilprednizolon sodyum süksinat intravenöz (500 mg/gün ile başlayan) iki hafta için.
5. İmmünsupresif ilaçlar 5.0-30.0 ng/mL için amaçlayan yalak kan düzeylerine göre günlük doz ayarlamakkafesi ve 1.0-3.5 µg/mL MMF için için sırasıyla. İdame dozu günde 50 mg ulaşılana kadar Metilprednizolon dozunu kademeli olarak azaltmak.
6. Profilaktik antibiyotik gentamisin yönetmek (3 mg/kg intravenöz) ve ceftiofur (5 mg/kg İntramüsküler) iki hafta için.

Açıklanan tekniği dört SLA büyük eşleşmeyen Yucatan minyatür domuz ve tibial VCA boyutu eşlemeli kullanarak yeniden gelen bir segmental tibial kusurları başarıyla gerçekleştirildi. Kemik allotransplant eşzamanlı besin gemi tamiri ve implantasyon allotransplant medüller kanal içinde alıcı hayvandan bir AV paket hemen kemik dolaşım ve gelişimi yeni bir otojen kan akımı izin zaman (şekil 1). 16 haftalıkken neoangiogenic dolaşım tüm tibial VCAs, Radyoopak Anjiyografik polimer (125 ml) femoral damarlarının içine enjeksiyon ve incelemelerine, sonra mikro bilgisayarlı tomografik (mikro-CT) anjiyografi tarafından görüntülenmiştir içinde kurulmuş tibial VCA (Şekil 2).

Resim 1 : Orthotopic tibial kemik VCA yordam. Cerrahi işlem gösteren şekil. (A)donör yordamı: hasat tibial kemik parçasının onun besin Transpediküler ile. (B) değişimi tibial kemik kesimleri arasında büyük SLA domuz uyumsuz. (C) alıcı yordamı: arteriyovenöz paket implantasyon: kafatası tibial damarları dikkatle medüller kanal eklenmiş. (D) anterior tibial Osteosentez tibial diaphysis, bölme ve plaka kas dalı besin Transpediküler mikrovasküler anastomoz. Tıbbi eğitim ve araştırma için Mayo Vakfı'nın izni ile kullanılır. Tüm hakları saklıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Bir decalcified tibial VCA parçasının temsilcisi 3D mikro-CT Anjiyografik görüntü. Neongiogenic dolaşım (sarı ok) sonra perfüzyon Radyoopak silikon çözüm ile tasvir edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Minyatür domuz sıkıntı veya kendi kendine sünneti belirtisi gösterdi. Enfeksiyon ve hayvanların normal ambulated, sonuçta ilk ameliyat sonrası günden beri ayı işletilen sağ bacak üzerinde tam ağırlığı mümkün olmadan tüm yaraları iyileşti. 16th haftalık çalışma uç noktada tüm Yucatan minyatür domuz üzerinde onların orijinal vücut ağırlığının % 150 kazandı (pretransplant: 56.0 ± 6,1 16 hafta posttransplant karşı: 84,5 ± 6.0).

Kafesi oluşan immünosupresyon, iki hafta kadar yeni bir otojen kan akımı allojeneik içinde kurulmuş besin Transpediküler yoluyla kan akışını korumak için mycophenolate mofetil (MMF) ve Metilprednizolon süksinat kullanılmıştır kemik allotransplant. 2 hafta boyunca ilaç kan düzeylerini değerlendirmek için Şah kateter immünosupresyon periyodik kan örnekleri alınmıştır. Doz 1-3,5 µg/ml için MMF (Tablo 1) ve 5-30 ng/ml kafesi için yalak kan seviyesini korumak için ayarlandı. Hiç uyuşturucu ile ilgili komplikasyonlar oluştu ve yalak düzeyleri kafesi için amaçlı ve mycophenolate mofetil (şekil 3 ve şekil 4) elde olabilir.

Tablo 1: kısa vadeli immünosupresyon protokolü. Tasvir immünsüpresif ilk 2 hafta için başlangıç dozu ile yazı ekimi kafesi, Mycophenolate mofetil ve prednizolon için iletişim kuralıdır. Ayrıca amaçlı yalak düzeyleri kafesi ve Mycophenolate mofetil ve prednizolon idame dozu için gösterilir.

Şekil 3 : Yalak kan düzeyleri kafesi için. Medyan ve kafesi için elde yalak seviyeleri üzerine ilk 2 hafta sonrası nakli interquartile dizi tasvir edilmektedir. Hata çubukları interquartile aralığı belirtmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Yalak kan düzeyleri için Mycophenolate mofetil. Medyan ve interquartile Mycophenolate mofetil 2 hafta kısa vadeli bağışıklık süre yalak kan düzeyleri yelpazesi gösterilir. Hata çubukları interquartile aralığı belirtmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

İki hafta sonra immünosupresyon kesilmesi rağmen işletilen sağ arka bacak x-ışınları ile (2, 4, 6, 10 ve 16 hafta) farklı zaman noktasındaki periyodik radyolojik değerlendirme ilerici kemik üzerinde çalışma şifa ortaya 16 hafta dönem tarafından kademeli iki bağımsız ve kör gözlemci (şekil 5)27,28. 16th hafta mikro-CT analiz birimi ve yoğunluk Kallus hem kemik oluşumunu ana bilgisayar/kemik VCA kavşaklar ve kemik VCA allotransplant görünüm27köprüleme ölçmek için kullanıldı. Azaltma veya kaybetmek, kaybı olmadan internal fiksasyon bakımından yeni otojen kan akımı tarafından terfi, gösterdiği28olabilir. Kemik Birliği tüm yırtılmalarıteşhis (şekil 6) elde edildi.

Şekil 5: Şifa ilerleme 16 hafta boyunca kemik. İlerleme bir doğrusal olmayan regresyon modeli şifa kemik belirlemek için kullanılmıştır. Değer R2 model uyum için veri belirlemek için kullanılmıştır. Hastanın ve lateral ilerlemenin VCA segmental Kemik defekti içine atan oldu kemik osseointegration farklı zamanda 25 puan en fazla değeri çalışma döneminde (2, 4, 6, 10 ve 16 hafta) tarafından iki puan üzerinde tabanlı bir skorlama sistemi kullanılarak bağımsız ve kör gözlemciler30,31. Doğrusal olmayan regresyon model medyan ve interquartile aralığı değerleri çalışma dönemi boyunca şifa kemik için tasvir (R2 0.931 =) 25 değeri 16 haftalıkken yaklaşıldığıdır ilerleme şifa sürekli kemik gösterilen. Hata çubukları interquartile aralığı belirtmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : Domuz tibial diaphysis üç boyutlu rekonstrüksiyon mikro bilgisayarlı tomografik değerlendirme sonra. Temsilcisi üç boyutlu görüntü yeniden oluşturulan Tibia iç plaka fiksasyon 2 x gerçek boyutu ile hesaplanır. Tibial kemik VCAs cerrahi angiogenez ile gösterilir sonra 16 haftalıkken Birliği tamamlayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ret (yok, hafif, orta ve şiddetli) sınıflandırma yukarıda açıklanan bir ölçek kullanma bölümlerine, lekeli Hematoksilen-Eozin undecalcified histolojik analizine şiddetli ret, mademki ret hafif ve orta belirtileri olabilir belirtisi ortaya üç domuz (Şekil 7)29gösterdi.

Şekil 7: Yatay bir Hematoksilen-Eozin temsilcisi görüntüsünü lekeli tibial VCA bölümünden. Radyoopak silikon çözüm dolu gemileri brown (yıldız işareti) görüntülenir. Hafif endosteal infiltrasyon ve reaksiyon (kalın ok) osteocytes (küçük ok) uygun olarak uygun kemik dolu lacunas üçte ile görülür. 10 X büyütme. Ölçek çubuğu 300 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.