Yalıtım F₁-ATPaz paraziter Protist Trypanosoma brucei üzerinden

F-tipi ATP synthases membran bağlı multiprotein kompleksleri arasında enerji transducing membranlar bakteri, mitokondri ve kloroplast ATP oluşumu ile bu iki proton translocation döner. Moleküler detaylarını ATP sentezi dönme mekanizması esas olarak saflaştırılmış bakteriyel ve mitokondriyal ATP synthases ve onların subcomplexes¹yapısal çalışmalar nedeniyle bilinmektedir. F-tipi ATP sentaz membran içsel ve dışsal membran moieties düzenlenmiştir. F₁olarak bilinen membran dışsal bölümü-ATPaz, adenozin nükleotittir (ADP) ATP veya ters tepki fosforilasyon oluştuğu üç katalitik siteleri içerir. F₁-ATPaz serbest deneysel olarak membran-iç yan hidrolize ama değil sentez, ATP yeteneğini koruyarak. F_o, denilen membran bağlı sektör enzim'ın dönüşü sürücüler protein translocation aracılık eder. F₁ ve F_o sektörlerde merkezi ve periferik SAP tarafından bağlanır.

İlk girişimleri F₁arındırmak için-1960'larda başa mayası ve sığır kalp mitokondri tarihi ATPaz. Kullanılan bu protokollerin sonication, amonyum veya protamine sülfat yağış, ardından isteğe bağlı Kromatografi adım (lar) ve ısıl işlem^{2,3,4 tarafından şeker tarafından kesintiye mitokondri çıkarılan ,5,6}. Arıtma büyük ölçüde geliştirilmiş ve kolayca F₁bültenleri kloroform kullanılarak Basitleştirilmiş-ATPaz mitokondri zar parçaları⁷. Kloroform çıkarma sonra F₁ayıklamak için kullanılan çeşitli hayvan, bitki ve bakteriyel kaynakları (Örneğin, fare karaciğer⁸, Mısır⁹, Arum maculatum¹⁰ve Escherichia coli - ATPases ¹¹). Daha fazla arıtma kloroform serbest F₁-ATPaz benzeşme veya boyut-dışlama Kromatografi (sn) tarafından x-ışını kristalografisi tarafından yüksek çözünürlüklü yapı belirlenmesi için uygun, bir son derece saf protein kompleksi, vermiştir olarak F₁yapılar tarafından belgelenen-ATPaz sığır kalp^12,13 ve Saccharomyces cerevisiae¹⁴. F₁-ATPaz yapıları da yetiştirmek zor olan organizmalar tespit ve böylece, ilk biyolojik malzeme miktarını sınırlı. Bu durumda, F₁-ATPaz alt birimleri yapay olarak ifade edilen ve E. colikompleksi içine monte ve bütün Contegra enzim etiketli bir alt birim benzeşme Kromatografi ile tarafından saflaştırıldı. Böyle bir yaklaşım F₁belirlenmesine yol açtı-ATPaz yapıları iki termofilik bakteriyel türler, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ ve Caldalkalibacillus thermarum^{16, 17}. ancak, bu yöntem oldukça ökaryotik F₁için uygun değildir - prokaryotik protheosynthetic aparatı, ardından işleme ve karmaşık derleme dayanan bu yana ATPases.

Kloroform tabanlı ayıklama daha önce F₁ayırmak için kullanılan - ATPases tek hücreli digenetic parazitler Trypanosoma cruzi¹⁸ ve T. brucei¹⁹, Amerikan neden önemli memeli patojenlerin ve Afrika trypanosomiases, sırasıyla ve monogenic böcek parazit Crithidia fasciculata²⁰. Bu purifications liderliğindeki F₁' in sadece basit bir açıklaması için - herhangi bir aşağı akım uygulama tam bileşimi, yapısı ve karmaşık enzimatik özelliklerini tanımlamak için kullanılan bu yana ATPases,. Bu makalede, F₁için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi-kültürlü böcek yaşam döngüsü sahne alanı'ndan ATPaz arınma T. brucei. Yöntem dayalı olarak kurulan iletişim kuralları yalıtım sığır ve Maya F₁- ATPases^21,22için geliştirilmiştir. Yordamı son derece saf ve homojen enzim vitro enzimatik ve inhibitör deneyleri için uygun detaylı proteomik karakterizasyonu kütle spektrometresi²³ve yapı belirlenmesi²⁴tarafından verir. Arıtma Protokolü ve bilgi F₁-ATPaz yapısı atomik düzeyde küçük molekül inhibitörleri tanımlamak ve Afrika trypanosomiases karşı yeni ilaçların geliştirilmesi yardım ekranları tasarlamak için bir olasılık açar. Ayrıca, protokol F₁arındırmak için adapte edilebilir-ATPaz üzerinden diğer organizmalar.

1. arabellekleri ve çözümleri

1. Aşağıda listelenen çözümleri hazırlayın. Sıvı kromatografi için tüm arabellekleri degas. ADP, benzamidine ve proteaz inhibitörleri kullanmadan önce ekleyin.
   1. Hidroklorik asit (Tris-HCl) pH 8.0, 0.25 M sukroz, 5 mM benzamidine, 5 mM ile arabellek A: 50 mM Tris tampon aminocaproic asit (ACA) ve proteaz inhibitörleri (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin ve 50 µM diprotin A) hazırlayın.
   2. Arabellek B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M Sükroz, 4 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 5 mM benzamidine, 5 mM ACA, 1 mM ADP ve proteaz inhibitörleri (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin ve 50 µM diprotin A) hazırlayın.
   3. Q-sütun arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO₄, 5 mM benzamidine, 5 mM ACA ve 1 mM ADP.
   4. Q-sütun elüsyon arabellek hazırlamak: 1 M NaCl ile Q-sütun tampon.
   5. SN arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
   6. 2 M Tris-HCl pH 8,5 ile doymuş kloroform hazırlayın. Mix kloroform ile yaklaşık 1:1 oranında bir vidalı kapak şişe 2 M Tris-HCl pH 8,5, sallamak, organik ve sulu fazlar ayrı izin ve pH pH-gösterge kağıt bir şerit ile sulu üst katmandaki ölçmek. Oda sıcaklığında saklayın. Sadece kullanmadan yeniden sallamak ve ayrı aşamadan izin. Alt kloroform katmanı'nı kullanın.
      Dikkat: Kloroform uçucu ve gözleri ve cildi için rahatsız edici. Bir duman mahallede çalışıyorum. Sallayarak Emanet gözlük kullanın.

2. alt mitokondrial parçacıklar hazırlanması

1. Mitokondrial veziküller (mitoplasts) 2 x 10¹¹ hücreleri procyclic T. brucei buz gibi soğuk arabellek A. örnek adım kadar 3.2 soğuk tutun 5 ml 1 x 10¹¹ hipotonik lizis²⁵ tarafından izole resuspend.
2. Bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil²⁶ üreticinin yönergelerine uygun olarak süspansiyon protein konsantrasyonu belirlemek.
   1. Ultrasaf Su Sığır serum albumin (BSA) seyreltme serisinde standart eğri oluşturmak için kullanın. Örnek aralığı BSA standartları sığacak şekilde 20 - 100 kez Ultrasaf Su ile küçük bir miktar oranında seyreltin.
   2. Örnekteki toplam protein miktarı hesaplamak ve protein konsantrasyonu 16 mg/ml ek arabellek A. sulandrarak getirmek
3. Parçalara ayırması mitoplasts ters veziküller ve membran parçaları süspansiyon 7 sonication tarafından 15 x 70-100 J dürtü ile bir microtip başına bir toplam enerji 3.9 mm çapında bir iyimsersin. Ultrasonik homogenizer enerji çıkışı görüntülemiyorsa, maksimal güç % 50 optimizasyonu başlatın. Örnek için 30 buz üzerinde kuluçkaya s dürtüler arasında. Sonication sonra süspansiyon biraz daha koyu olur.
4. Ultrasantrifüj 54.000 x g 16 h için veya 98.000 x g 4 ° C'de 5 h için tarafından sediment membran parçaları Süpernatant dikkatle boşaltmak ve kloroform çıkarma ile devam ya da flash-tortu sıvı azot donma ve-80 ° C'de saklayın

3. serbest bırakmak-in F₁-ATPaz zar kloroform tarafından

1. Mitokondrial membranlar Pelet tampon B küçük bir Dounce homogenizer yardımı ile resuspend. Arabellek B hacmi tabanlı arabellek miktarı kullanılan bir adım 2,1 ve 2,2 aşağıdakileri kullanarak formülde hesaplama: birim (tampon B) birim (a tampon) x 12/21 =. Süspansiyon 15 veya 50 mL konik tüp aktarın.
2. Örnek buz kaldırın ve şu andan itibaren örnek ve oda sıcaklığında kullanılmak üzere tüm çözümler tutun.
3. 2 M Tris-HCl pH 8,5 ile doymuş kloroform ekleyin; Eklenecek kloroform hacmi süspansiyon yarım hacmi eşittir. Kapağı sıkıca kapatın. Tam olarak 20 için şiddetle çalkalanır s. santrifüj kapasitesi bunu hemen 8.400 x g oda sıcaklığında 5 min için de.
4. Transfer üst bulutlu sulu faz 1.6-mL mikrotüpler. Proteaz inhibitörleri (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin ve 50 µM diprotin A) tarafından kloroform tedavi kaldırıldı inhibitörleri yerine ekleyin. 13.000 x g için oda sıcaklığında 30 dk de örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant temiz mikrotüpler için transfer ve çözünmez herhangi bir malzeme çıkarmak için aralıklarla tekrarlayın.

4. anyon-Satım Kromatografi

1. 280 absorbans kadar hızlı proteinli sıvı kromatografi sistemi ile Q-sütun arabellek 5 mL/dk akış hızında bağlı 5 mL anyon exchange (Q) sütun equilibrate nm ve iletkenlik stabilize (arabellek yaklaşık 50 mL).
2. 280 adımda 3.3 dengelenmiş sütun 1 mL/dak bekle absorbans kadar akış hızında süpernatant yüklemek nm stabilize vasıl geçmiş. Q-sütun elüsyon arabelleğe % 0'dan %100 0.5 mL/dak toplamak 1 mL kesirler akış hızında bir 25 mL doğrusal degrade uygulayın.
3. PH 8.0 Pullman ATPaz tahlil² ATP hydrolytic aktivite büyük elüsyon tepe karşılık gelen bireysel kesirler tahlil. Her kesir tepki karışımdan 1 mL başına 10 µL kullanın. ATPaz aktivitesi gösteren kesirler havuz. İsteğe bağlı olarak, her kesir Sodyum Lauryl fosfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) üzerinde 10 µL ayrı ve Coomassie bireysel F₁görselleştirmek için mavi jel leke-ATPaz alt birimleri ve bulaşıcı proteinlerin.
4. Membran Ultrafiltrasyon ile 100.000 MWCO PES filtre için 200-500 µL. spin sütun kullanarak tarafından havuza alınan örnek devam sn veya mağaza oda sıcaklığında gecede örnek için konsantre ol.

5. boyut-dışlama Kromatografi

1. Bir sıvı kromatografi sistemi ile en az 48 mL (iki sütun birim) 0.5 mL/dk akış hızında sn tamponunun bağlı sn sütun equilibrate.
2. Örnek sütun üzerinde uygulamak ve Kromatografi 0.25 mL/dak debi ödemeli 0.25 mL kesirler çalıştırın.
3. UV_280nm absorbans izleme SDS-sayfasında doruklarına karşılık gelen ve onları Coomassie mavi tarafından leke kesirler 10 µL çalıştırın. İlk büyük tepe F₁içerir-ATPaz. Bu tepeye kadar ATP hydrolytic etkinliği ve azid hassasiyeti Pullman ATPaz tahlil tarafından karşılık gelen kesirler tahlil. Protein konsantrasyonu tarafından BCA tahlil belirlemek.
4. Arıtılmış F₁tutmak-ATPaz, oda sıcaklığında ve içinde 3 d arıtma sonra aşağı akım uygulamalarda kullanabilirsiniz. Alternatif olarak, 100.000 MWCO PES Filtre > 1.5 mg / pH 8.0 (1.2 x birim) için doymuş amonyum sülfat ile karıştırma tarafından ayarlanır ml, acele ile bir spin sütun kullanarak örnek konsantre ve 4 ° C'de depolayın

T. brucei hücreleri25 standardında kültürlü mitokondrial veziküller (mitoplasts) üzerinde 2 x 1011 procyclic hypotonically lysed 1 x 1011 Percoll degradeye izole tipik arıtma (Şekil 1) başlar glikoz zengini SDM-79 Orta27. Mitoplasts döndü, sonication tarafından parçalanmış ve matris içeren süpernatant atılır. Mitokondrial membranlar F1serbest bırakmak için kloroform ile tedavi edilir-ATPaz. Santrifüjü sonra organik faz ve zarlarını Interphase atılır. Sulu faz iyon değiştirme Kromatografi kuaterner amonyum, güçlü anyon değiştirici (Şekil 2A) üzerinde tarafından şeker. Büyük elüsyon karşılık gelen kesirler zirve ve F1içeren-ATPaz havuza alınmış ve konsantre. Bu malzeme artık yabancı maddeleri ortadan kaldırır sn için giriş olarak hizmet vermektedir. Önemli kirletici koyu yeşil çubuk Şekil2B işaretlenmiş ayrı bir zirve olarak sn sütundan elutes dihydrolipoyl dehidrogenaz var. F1-ATPaz elutes ilk baskın, büyük ölçüde simetrik tepe (Şekil 2B).

İlerleme arınma ardından BCA protein tahlil (veya başka bir ortak protein tahlil), SDS-sayfa ve ATPaz etkinliğini izlemeye. ATP hidroliz hızına tahlil2NADH absorbans eşleşmiş tepki azalma göre Yenileyici Pullman ATP ölçülür. Sodyum azid, F1kurulan bir inhibitörü-ATPaz, 2 mM konsantrasyon F1oranı belirlemek için kullanılan-ATPaz-belirli ATP hidroliz. Genellikle, giriş malzeme kabaca 150-300 mg mitokondrial veziküller kaynağı olarak kullanılan hücre sayısına bağlı olarak mitokondriyal protein içerir. Toplam ATPaz aktivitesi azid duyarlı oranı bu aşamada % 30-40 civarındadır. Kloroform çıkarma sonra fazla % 90 ATPaz aktivitesi örnek F1olarak katkıda-ATPaz. Arıtılmış F1- ATPaz azid tedaviye (etkinlik için arka plan ATP otoliz atfedilen çok az kalıntı ATPaz) neredeyse tamamen duyarlıdır ve yaklaşık 1 yaklaşık bir verimini yüzde 1'giriş protein kütlesinin temsil eder - 1.5 mg F1-ATPaz başına 1 x 1011 hücreleri (Tablo 1). Arıtılmış F1ayrılması sonra tipik grup desen-ATPaz SDS-sayfa jel Coomassie boyama Mavi tarafından takip üzerinde Şekil 2Ciçinde gösterilir. Proteinler parmak izi ve ayrıntılı olarak çeşitli kütle spektrometresi yaklaşımlar23tarafından karakterize peptid kitle tarafından tespit edilmiştir. Sporadik zayıf bantları β-alt birim grubu görünür subcomplexes α3β3 başlığın (dimer ve reaksiyonlar, α - ve β-alt birimleri) hem de herhangi bir kirletici hassas kütle spektrometresi teknikleri tarafından algılanabilir yoksun olan. Arıtılmış F1-ATPaz için depolanan sn arabellek oda sıcaklığında birkaç gün kadar. Alternatif olarak, F1-ATPaz ≥2 mg/mL konsantre çöktürülmüş doymuş amonyum sülfat sn arabellekte eşit bir hacmen 8.0 için ayarlanabilir ve 4 ° C'de depolanan pH ile En az altı ay sonra yağış için herhangi bir alt birim açık hiçbir bozulma ile etkin enzim sn arabellek veya benzer çözüm zarlarını malzeme redissolving tarafından elde edilebilir. Ancak, depolama bir aydan daha uzun ampirik olarak belirlenen kristalizasyon için uygun değildir.

Resim 1 : Arıtma yordamı düzeninin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : İki adım arıtma kloroform serbest F1-sıvı kromatografi tarafından ATPaz. (A)elüsyon profil anyon-Satım Kromatografi (üst paneli) ve seçili kesirler ayrılmış Coomassie mavi boya (alt paneli) ile lekeli % 10 - % 20 Tris-glisin SDS-sayfa jel üzerinde. Mavi izleme: UV absorbans 280 nm; Kırmızı izleme: NaCl konsantrasyon elüsyon arabellekte; Giriş: F1-ATPaz yayımlanan kloroform tarafından; FT: akış yoluyla. (B), sn (üst paneli) ve seçili kesirler elüsyon profil ayrılmış Coomassie mavi boya (alt paneli) ile lekeli SDS-sayfa jel üzerinde. Giriş: havuza alınmış kesirler üzerinden F1içeren anyon-Satım Kromatografi-ATPaz. Paneller A ve B renk kodlu barlarda kesirler SDS-PAGE tarafından analiz edildi elüsyon profilleri ve ilgili jel içinde karşılık gelen yolları mark. (C) kimliklerini tek tek protein izole F1-kütle spektrometresi tarafından tanımlandığı gibi ATPaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Tipik ilerleme ve verim F1örneği-ATPaz arıtma mitokondri 1 x 1011 procyclic T. brucei hücreleri izole dan.

Yazarlar ifşa gerek yok.