Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.
Hücreleri hissediyorum ve mekanik uyaranlara mechanotransduction denen bir süreç biyokimyasal olarak algılanabilir sinyallere dönüştürerek kendi ortamlarında fiziksel ipuçları yanıtlar. Mechanotransduction çok önemli bir adım güçleri iç ve dış ortamlar arasında iletimi yapılır. İletmeye zorlar, protein-protein etkileşimlerinin bir dizi tarafından oluşturulan sürekli, kesintisiz bir fiziksel bağlantı olması gerekir. Verilen protein-protein etkileşimi için mekanik yük ya da etkileşim üzerinde bir etkisi olabilir, etkileşimin daha hızlı ayırma için kurşun ya da etkileşim stabilize etmek. Nasıl moleküler yük anlama protein devir oranı canlı hücreler, buna karşılık mechanotransduction rolü elucidating bir protein, mekanik durumu hakkında değerli bilgiler sağlayabilir belirler. Kuvvet duyarlı protein dynamics ölçmek için varolan teknikleri protein yük doğrudan ölçümleri eksikliği veya hücresel bağlam dışında gerçekleştirilen ölçümlere kullanmaz. Burada, biz kuvvet duyarlı protein dynamics canlı hücreler içinde ölçüm sağlar photobleaching (FRET sıkı bağlamak) tekniği sonra Förster rezonans enerji transferi-floresan kurtarma için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu teknik potansiyel olarak herhangi bir gerginlik FRET tabanlı sensörü, kuvvet duyarlı protein dynamics hücre altı yapıları çeşitli ve farklı hücre tipleri çalışma kolaylaştırmak için geçerlidir.
Hücre dışı ortam hücre davranış dikte fiziksel ve biyokimyasal cues zengin bir kaynağıdır. Özellikle, microenvironment fiziksel yapısı anahtar hücresel işlevler, hücre büyümesi, geçiş ve farklılaşma1,2,3,4de dahil olmak üzere arabuluculuk. Bozukluk microenvironment mekaniğinin henüz yeterli tedavi, kanser5, ateroskleroz6ve fibrozis7gibi var mı birçok hastalık için önemli bir bileşenidir. Nasıl fiziksel uyaranlara biyokimyasal olarak algılanabilir sinyalleri hücreleri dönüştürme tam bir anlayış, bir süreç mechanotransduction olarak adlandırdığı, aydınlatma güç iletim, içine ve hücrelere arabuluculuk moleküler mekanizmaları gerektirir ve birden çok hücre altı yapıları içinde.
Hücre altı yapıları içinde proteinler sürekli dönüm; bağlama ve ortakları8binding ile ilişkileri gücüne dayalı kesmeden. Başarılı bir şekilde fiziksel bir mesafe iletilebilmesi için güçlerini için protein-protein etkileşimleri, protein ciro sürdürmek ve onun bağlama ortak9güç iletimi yeterince yavaş olmalıdır anlam zinciri olmalı. Protein-protein etkileşimler genellikle, birkaç sigara-Kovalent bağlar protein etki alanları arasında oluşur iken, etkileşim kez farklı koşullarda10, altında ilişkisiz bir duruma geçiş yapabileceğini ilişkili bir devlet olarak kavramsallaştırma 11. verilen protein-protein etkileşimi için kuvvet etkisi üzerinde bir “ideal bond” olarak bilinen etkileşim, ömrünü, ömür boyu bir “slip bond” olarak bilinen etkileşimin azaltmak ya da etkileşim ömrünü artırmak Hayır olabilir mümkündür , bir “catch bond”10da bilinir. Böylece, protein yük ve biz kuvvet duyarlı dynamics bakın protein dinamikleri arasında karmaşık bir ilişki vardır.
Yük etkisi bond dynamics anlayış doğru son derece bilgilendirici deneyler bir dizi tek molekül düzeyde gerçekleştirilmiş. İzole protein veya proteinler ve manipülasyon teknikleri manyetik cımbız, Optik cımbız ve atomik kuvvet mikroskobu gibi parçaları kullanarak, bu çalışmalar için birkaç ilgili kuvvet duyarlı protein-protein etkileşimleri göstermiştir proteinler11,12. Transmembran proteinler hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri, sırasıyla şekillendirme için önemli olan her iki integrinler13 ve kaderin14, yüklemek için dinamikleri değişiklik göstermiştir. Hücre içinde vinculin her iki talin15 ve α-catenin16 için bir kuvvet bağlı şekilde oluşturulmuştur ve aktin17vinculin fokal yapışıklıklar (FAs) ve adherens kavşaklar (AJs için çok önemli bir rol gösteren, bir catch Bono oluşabilir ) yük altında. Tek molekül çalışmaları belirli protein-protein etkileşimleri yalıtım için izin ve kesin sonuçlar, ama onlar hücresel ortamı karmaşıklığı için hesap yapmak.
Landmark deneyler FAs ve AJs, dahil olmak üzere birkaç hücre altı yapıları mechanosensitive vardır ve dahili olarak oluşturulan veya dışarıdan uygulanan yük18,19yanıt olarak geliştirilmiş derleme sergi gösterdi, 20,21,22. Ayrıca, çeşitli teorik modeller mechanosensitive derleme kuvvet duyarlı protein dynamics23,24,25tarafından tahrik tavsiye ettiler. Bu kuvvet duyarlı dinamikler canlı hücreler içinde incelemek için birkaç dolaylı yaklaşımlar atılmıştır. Sıkı bağlamak ve ilgili teknikleri protein dynamics hücreleri26,27,28,29ölçmek için nispeten basit bir yöntem sağlar. Ancak, protein yük ölçümü daha sınırlı olmuştur. Protein dynamics ve genel hücre contractility8,30,31azaltmak için kullanılan bir hücre iskeleti inhibitörü maruz olmayan hücrelerdeki karşılaştırmak için tipik bir yaklaşımdır. Kavramsal olarak, bu yüksek yük ve düşük yük durumu arasında bir fark var. Ancak, her iki devlet arasında protein hiçbir miktar yük yoktur ve engelleyici, böyle bir F-aktin Filaman boyunca anahtar bağlayıcı siteleri kaybı istenmeyen biyokimyasal etkileri olabilir. Başka bir yaklaşım, FAs için belirli toplam kuvvet efor moleküler yük yaklaşık ve SK32içinde tek bir protein dinamikleri ile ilişkiyi incelemek için çekiş kuvveti mikroskopisi kullanılarak FA tarafından substrat olarak ölçmek için olmuştur. Bu yaklaşım toplam kuvvet miktar için izin verirken, tatlı bilgi sağlamaz. FAs birçoğu yük33ayı 200’den fazla farklı proteinlerin oluşur. Böylece, bir SK toplam güç çıkışını potansiyel olarak ölçüm birden çok güç iletim yolları olasılığı gizler ve güvenilir bir şekilde yük ölçüsü belirli bir protein sağlamaz.
Mechanobiology önceki yaklaşımlar, FRET tabanlı gerilim sensörler gelişiyle doğrudan sağlar ölçüm spesifik proteinlerin yaşam içinde yaşadığı yük hücreleri34,35,36. Burada, FRET tabanlı gerilim sensörler protein dynamics sıkı bağlamak tabanlı ölçü ile birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Biz bu teknik için FRET sıkı bağlamak bakın. Bu yaklaşım protein yük ve protein dinamikleri, böylece canlı hücreler (Şekil 1) kuvvet-duyarlı protein dinamiklerini değerlendirmesini sağlayan eşzamanlı ölçüm sağlar. Zaten, mekanik bağlayıcı protein vinculin37kuvvet duyarlı dinamikleri çalışma odasına perde sıkı bağlamak tekniği uygulanmıştır. Gerginlik sensörler hücre altı yapıları çeşitli ilgili çok sayıda proteinler için geliştirilmiştir. Örneğin, sensörler vinculin34 ve talin38,FAs, kaderin ve catenins AJs40,41,42, nesprin nükleer LINC karmaşık içinde39 için geliştirilmiştir. 43, α-Aktinin44 ve filamin36 sitoiskeleti ve MUC-1 glycocalyx45, diğerleri arasında ‘46. Benzer şekilde, yaygın olarak kullanılan bir teknik mechanosensitive proteinler odak yapışıklıklar8,31, adherens kavşaklar47, aktin korteks26ve çekirdek48içinde üzerinde kullanılan sıkı bağlamak ‘s. Varolan bu sensörler veya yeni perde sıkı bağlamak tekniği için geniş uygulanabilir olmalıdır ilerlemeye sensörler, kuvvet duyarlı dynamics hücre altı yapıları ve bağlamlarda geniş çeşitli ölçümler için izin geliştirdi. Bu amaçla doğru biz perde sıkı bağlamak tekniği bu farklı sistemlerde geçerli uygulama için ayrıntılı, genelleştirilmiş bir protokol sağlar. Umarım, bu çok çeşitli rolleri çeşitli mechanosensitive protein güç iletim düzenleyen ve hücre davranış arabuluculuk elucidating deneyler sağlayacaktır.
Kuvvet duyarlı protein dinamikleri, doğrudan canlı hücreler içinde soruşturma zor olan bir özelliği doğrudan ölçümü için FRET sıkı bağlamak yöntemi sağlar. Protein dynamics moleküler yük duyarlılığını bir kuvvet verici veya dönüştürücü olarak protein’ın çalışması için önemlidir. Yükleme hem de dahili olarak oluşturulan iletimi için gereklidir ve dışarıdan uygulanan kuvvetler, mechanotransmission aradı ve biyokimyasal olarak algılanabilir sinyalleri bu kuvvetlere dönüştür…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser hibe Amerikan Kalp Derneği (16GRNT30930019) ve ulusal Dr Brenton Hoffman ve bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM121739-01) yanı sıra Ulusal Bilim Vakfı Kariyer Ödülü (NSF-CMMI-14-54257) tarafından desteklenmiştir Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu Katheryn Rothenberg için ödüllendirildi. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka NSF veya NIH resmi görüşlerini temsil etmiyor.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |