SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Exosomes bir alt türü hücre dışı veziküller (EV) çapında bağışıklık hücreleri^1,2gibi çeşitli hücre tiplerinin tarafından salgılanan, 50-200 nm arasında değişen, kanser hücreleri^{3,4,5, 6} ve kök hücreleri⁷. Exosomes ayrıca çeşitli fizyolojik sıvıları^8,9,10,11' in bulunması için gösterilmiştir. Exosomes doğal yeteneğini çeşitli biomolecules (Örneğin, RNA ve proteinler)^12,13,14 taşımak ve bu biomolecules etkili teslim alıcı hücreye ^{15 , 16 , 17} nano ölçekli ilaç teslim vektör olarak potansiyellerini için ilgi çekici. Anti-kanser ve anti-inflamatuar ilaçlar exosomes başarıyla yüklenebilmesi için gösterdi ve hedef hücreleri^18,19,20, teslim hizmet çeşitli küçük moleküller ^{21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27}. ilginçtir, nükleik asitler siRNA^28,29 ve mikroRNA³⁰ gibi Ayrıca exosomes üzerinden Elektroporasyon başarıyla yüklendiğinde ve hedef hücrelere teslim.

Son zamanlarda, RNA müdahale (RNAi) yolu ile küçük müdahale RNA (siRNA) yüksek özgüllük, güçlü etkisi, en az yan etkileri ve siRNA sentez^{28kolaylığı nedeniyle gen suskunluğu tercih edilen mekanizması olarak daha fazla ilgi kazanmıştır, 29}. Çift Çift iplikçikli RNA molekülleri 19 25 nükleotid uzunluğunda bu Tetikleyicileri fingerprinting katalitik mRNA nakavt arasında değişen vardır. Onun büyük molekül ağırlığı ve polyanionic doğa, hücre içine çıplak siRNA pasif alımını engel^28,29gelir. Ayrıca plazma nükleaz³¹tarafından sistemik dolaşım hızlı yıkımı nedeniyle içine enjekte edilir çıplak siRNA mümkün değildir. Böylece, bir nanocarrier içinde siRNA encapsulation etkili teslim ve siRNA alımını hedef hücrelere yardım.

Fosfolipid bilayer tarafından zarflı bir içi boş, sulu çekirdek yapısı oluşan siRNA Kapsülleme için ideal bir sistemdir Exosomes şunlardır. Exosomes sadece iyi istikrar kan içinde var ama aynı zamanda işlevsel RNA hücre³²sunmak için doğal hedefleme özellikleri vardır. Alvarez-Erviti ve ark. tarafından başarıyla yürütülen çalışma kullanarak farelerin beyinlerinin etkili teslim edilmesi siRNA, hemen hemen hiçbir komplikasyon³¹' le exosomes mühendislik gösterdi. Ya tabanlı terapisi hücreleri ve bu nedenle metastatik özellikleri¹⁵sergi değil exosomes endogenously çoğaltılmaz gibi diğer tedaviler nispeten daha güvenli olan.

Başarılı bir şekilde exosomes hücre kültürü veya fizyolojik sıvıları izole etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. En popüler yöntem ultrasantrifüj başlangıç malzeme^31,32,33üzerinden exosomes cips için kullanır. Bu yöntem oldukça exosomes ve genellikle eş precipitates proteinler örnekten sert olabilir. Sükroz gradyan gibi Yoğunluk tabanlı ayırmalı ultrasantrifüj birleştirerek protein ve sigara exosomal kirlenme izole exosomes^19,34azaltmak için daha yaygın hale geliyor. Boyut-dışlama Kromatografi (sn) boyutuna göre exosomes ayırma ekstraselüler veziküller (EV) diğer tür verir ve de en az protein kontaminasyonu neden olabilir ama^{35işleyebilir malzeme başlayan küçük miktarda sınırlıdır, 36}. Exosomal tetraspanins veya EVs yerine exosomes özel yakalama sağlar diğer hücre özgü marker gibi yüzey proteinleri veya diğer proteinler bağlamak antikorlar ile kaplanmış gibi alt nüfusu yalıtma boncuk Immunoaffinity yakalamanın kullandığı exosomes gelen tüm örnekleri, ama tekrar malzeme başlayan miktarla sınırlı ve pahalı^36,37. Polimer esaslı yağış exosomes, eskiden çok popüler olduğu, ama bu oldukça kaba bir yağış olduğundan, bir daha yüksek exosomal sigara vezikül ve protein kontaminasyonu^38,39için yol açar.

Elektroporasyon exosomes siRNA nedeniyle protein toplama^15,28,31ile yüklemek için bir yöntem olarak onun verimsizlik için bildirilmiştir. Transfection tabanlı yaklaşımlar daha iyi verim ve protein istikrar yükleme için gösterdi ama toksisite ve hücresel gen ifade²⁸değiştiren içinde transfection ajanların yan etkileri nedeniyle istenmeyen. Böylece, Elektroporasyon daha güvenli bir yöntem olduğu gibi exosomes siRNA yüklenirken daha yaygın olarak kullanılmıştır. Ancak, bir en iyi duruma getirilmiş sarma yöntemi hedef site için güçlü gen köşenize siRNA yeterli miktarda sunmak amacıyla kurulan gerekir.

Burada, yoğunluk tabanlı ultrasantrifüj döteryum oksit yerine sukroz yoğunluğu degrade hazır sadece bir tek %25 (w/w) sükroz yastık üzerine bir eksozom yalıtım iletişim kuralı'nı öneriyorum. Bu zahmetli yoğunluk gradient hazırlık kaçınmanızı sağlar ve malzeme başlayan geniş hacimli işleme izin verir, yine de yüksek verim ve saflık siRNA ile sonraki yükleme için uygun olduğu gibi exosomes sonuçlanan düşük maliyetli bir yöntemdir. Floresan Atto655 Birleşik non-spesifik siRNA insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-293 hücreleri) elde edilen exosomes üzerinden Elektroporasyon yüklenen ve insan pankreas adenokarsinom (PANC-1) kanser hücrelerinin teslim tüp bebek.

1. hücre kültüründe bir biyoreaktör şişesi

Resim 1: bir biyoreaktör şişesi eksozom üretim için hücre kültür. (A)Basitleştirilmiş biyoreaktör şişeye anatomisi. (B) başlangıç biyoreaktör şişeye kültür. Normal ve ya tükenmiş Orta (C) hasat şartına Orta (CM) bileşimi ve biyoreaktör şişeye kültür için Tablo malzemeleri görmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. Kültür HEK-293 hücreleri normal ortamda (bakınız Tablo malzemeler; %5 CO₂, 37 ° C) ve onları 4 x T75 şişeler (kadar % 90 birleşmesi) genişletin.
2. Biyoreaktör şişeye membran biyoreaktör şişeye orta rezervuarı 50-100 mL normal Orta ekleyerek ıslak.
3. 4 x T75 ve resuspend tüm HEK-293 hücreleri toplamak onları eksozom tükenmiş orta 15 mL ( Tablo malzemelerigörmek).
4. Künt dolgu bağlı 20 mL şırınga kullanarak biyoreaktör şişeye hücre bölmesinin HEK-293 hücre süspansiyon eklemek (bkz. Tablo reçetesi) oluşmuş herhangi bir kabarcık kaldırmak için özenle iğne.
5. Biyoreaktör şişeye orta rezervuarı normal Orta ile bir hafta boyunca 500 mL ve devam inkübatör (%5 CO₂, 37 ° C) şişeye doldurun.

2. şartına Orta (CM) biyoreaktör Flask hasat

1. 1 hafta sonra biyoreaktör şişeye orta rezervuarı ortamda atmak.
2. Tüm Orta kaldırın (Örneğin, CM) hücre kompartımanda 20 mL şırınga kullanarak bir künt dolgu iğneye bağlı.
3. 50-100 mL normal orta orta havzanın ekleyin.
4. Ya tükenmiş orta 15 mL eski orta kaldırma ve taze eksozom tükenmiş orta bir künt dolgu iğneye bağlı 20 mL şırınga kullanarak ekleyerek hücre bölmesi ekleyin.
5. Biyoreaktör şişeye orta rezervuarı normal Orta ile 500 mL ve devam inkübatör (%5 CO₂, 37 ° C) şişeye bir hafta daha doldur.
   Not: Kültür fazla bir yıl boyunca devam edilebilir. Adım 2.2, ilk hasat CM eksozom yalıtım için kullanılmaz ve atılır. 2^nd ve sonraki hasat için CM eksozom yalıtım için tutulur.

3. eksozom yalıtım sükroz yastık üzerine

Şekil 2: izolasyon ve exosomes karakterizasyonu. (A)öncesi takas hasat şartına ortamından (CM) ölü hücreleri ve hücre artıkları. (B) sükroz yastık üzerine cm exosomes izole. (C) sükroz ve bulaşıcı proteinlerin kaldırmak için adım yıkama. (D) izole exosomes sonra fizikokimyasal, biyokimyasal ve morfolojik karakterizasyonu için tabi tutuldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. (Kimden adım 2.2) CM fark Santrifüjü ve filtrasyon tarafından aşağıdaki gibi önceden temizleyin.
   1. 4 ° C'de 5 min için 500 x g, santrifüj Süpernatant yeni bir tüp içine aktarmak ve Pelet atın. Süpernatant kurtarma ve Pelet atarak bu aralıklarla bir kez daha tekrarlayın.
   2. Adım 3.1.1 2.000 x g 15 dk ve 4 ° C de süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet atın. Kurtarılan süpernatant bir kez 0,22 µm filtreler aracılığıyla filtre.
2. Ön temizleme sırasında döteryum oksit % 25 (w/w) sükroz çözümde 1.9 g (± 0.001 g) sükroz evrensel bir tüp dışarı doğru tartım ve ağırlığı 7.6 g (± 0.001 g) ulaşıncaya kadar sonra döteryum oksit ile kontör hazırlayın.
3. Bir ultracentrifuge doldurmak tüp ( Tablo malzemelerigörmek) önceden temizlenmiş CM. makyaj 0,22 µm filtre ile 22,5 ml CM 22,5 mL ile geçerli birim ise PBS bu daha az.
4. Bir cam tüp pipet ( Tablo malzemelerigörmek) ve, 3 mL sukroz çözüm çözüm CM altında ayrı bir katman oluşturur, ekleyin bir yer.
5. Dikkatli bir şekilde yer tüp içeren bir swing-out rotor kova içine CM/sükroz çözüm katmanlı (bkz. Tablo reçetesi) ve kova rotor güvenli.
6. Rotor ultracentrifuge yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve 100.000 x g 4 ° C'de 1,5 saat için spin
7. 2 mL sukroz tabakasının toplamak ve bu bir ultracentrifuge biberondan Ekle ( Tablo malzemelerigörmek) 20 mL içeren filtre uygulanmış PBS için bir yıkama adım.
8. Tüpler bir sabit açılı rotor yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve 100.000 x g 4 ° C'de 1,5 saat için spin
9. Dikkatle süpernatant 10 mL serolojik pipet ile kaldırın ve Pelet 400 filtre µL PBS ile resuspend. Bu ya hisse senedi 4 ° C veya-80 ° C kısa vadeli ve uzun vadeli depolama için sırasıyla tutun.

4. eksozom boyutu ve verim nanopartikül izleme çözümlemesi (NTA) tarafından karakterizasyonu

1. Yapmak 1:1, 000-1:50, 20-80 parçacıklar NTA görüntüleme çerçevesinde elde etmek için 1 mL (en az 750 µL) birimindeki eksozom stokunun 000 dilutions aleti (bakınız Tablo reçetesi) görüntüleme.
2. Seyreltilmiş eksozom hisse senedi 1 mL şırınga kullanarak NTA enstrüman örnek odasına enjekte ve sıcaklık probu giriş bir termometre sıcaklık probu takın.
3. NTA yazılım ayarlayın (bkz. Tablo reçetesi) aşağıdaki gibi kayıt için: 3 standart ölçüleri, 30 s her, el ile Sıcaklık seçeneği işaretlenmemiş; ve Gelişmiş sekmesi altında seyreltme faktörü girin.
4. 13 için kamera düzeyini ayarlayın ve örnek taze toplu enjekte ve her okuduktan sonra istendiğinde örnek oda sıcaklığını girerek NTA yazılım yakalama komut dosyasını çalıştırın.
5. 4 daha sonraki analiz bölümü için küme eşik ve ortalama kalıcı boyutu ve ölçümler eksozom stoktan parçacık konsantrasyonu unutmayın.

5. eksozom saflık parçacık: Protein oranı tayini tarafından karakterizasyonu

1. Protein içeriği bir bicinchoninic asit (BCA) protein tahlil tarafından eksozom stokunun kıt ( Tablo malzemelerigörmek) aşağıdaki gibi ölçü birimi.
   1. Hazırlamak standartları tanımlanan.
      1. Microcentrifuge tüp 45 µL BSA hisse senedi çözüm (2 mg/mL – tahlil Seti'nde sağlanan) ekleyerek en yüksek konsantrasyonu (500 µg/mL) standartları hazırlamak ve PBS ile 180 µL olun.
      2. 8 microcentrifuge tüpler PBS 90 µL ile doldurun.
      3. Seri dilutions yapmak (faktör: 0.5) 90 µL en yüksek BSA standart alarak ve bu 1^st microcentrifuge eklemek tüp PBS ile (mix iyi), o zaman bu tüp 90 µL alma ve 2^nd microcentrifuge tüp içine ekleyerek.
      4. 7 microcentrifuge tüp kadar bu işlemi yineleyin. 8 tüp sadece PBS olacak (Yani, boş: 0 µg/mL).
   2. Ya örnekleri 1:2 seyreltme PBS ile örneklerinin toplam hacmi çok 90 µL (45 µL örneği, PBS 45 µL) yaparak hazırlamak.
   3. Reaktif mix çalışma BCA hazırlayın.
      1. BCA gerekli reaktif mix (başı kuyuda çoğaltmaları, standartlar dahil olmak üzere 50 µL) çalışma hacmi hesaplamak.
      2. Aşağıdaki oranı göre bireysel BCA reaktifler mix: 25 parça reaktif A: 24 parça reaktif B: 1 Bölüm reaktif C.
   4. Tahlil ve çözümlemesi gerçekleştirin.
      1. 96-şey plaka (yineleme her standart ve örnek için) bir kuyuya yukarıda hazırlanan her standart ve ya örneğinin 40 µL ekleyin.
         Not: Bu kolorimetrik bir tahlil olduğu için uygun pipetting tekniği doğru sonuçlar elde etmek çok önemlidir. Her standart/örnek çoğaltılır her kuyu içine ekledikten sonra pipetler değiştirmek
      2. Reaktif karışımı her kuyuya çalışma protein testin 50 µL ekleyin ve plaka için 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
         Not: sapmalar çoğaltır arasında en aza indirmek için protein tahlil çalışma reaktif bir standart/örnek, 1^st REPLICATE eklemek için 1^st eklemeden önce 2^nd REPLICATE aynı örnek/standart, ardından başka bir örnek/standartları çoğaltmak.
      3. 562 absorbans ölçmek nm plaka okuyucu üzerinde ( Tablo malzemelerigörmek).
      4. Standartların absorbans değerleri üzerinden standart bir eğri arsa ve eğrinin denklemi kullanarak her örnek protein konsantrasyonu çalışmak.
2. Partikül: protein oranı yukarıdaki ölçülen eksozom stok protein konsantrasyonu ile edindiğiniz eksozom verim bölerek hesaplayın.

6. Exosomal Marker ifade tarafından akış sitometresi karakterizasyonu

1. Exosomes (≥1x10¹¹ parçacıklar/mL) 40 µL 10 µL aldehid/sülfat lateks boncuk (stoktan su katılmamış) ile 15 dakika oda sıcaklığında (RT) kuluçkaya.
2. 5 µL 100 µM BSA çözüm ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 10 mM nihai toplama ulaşmak için ve RT., 15 dk için kuluçkaya eksozom-boncuk karışıma
3. PBS 1 mL ekleyin ve bir microcentrifuge tüp üzerinde sallanan bir shaker (~ 150 devir/dakika) hafif ajitasyon ile RT, 75 dk için kuluçkaya.
4. Süspansiyon 580 x g RT, 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
5. Pelet 1 mL 100 mM glisin çözeltisi ile resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) ve 30 dk RT. az için kuluçkaya
6. 580 x g. atma, 5 min için süspansiyon süpernatant santrifüj kapasitesi ve pelet 1 mL % 3 ile resuspend FBS/PBS ( Tablo malzemelerigörmek).
7. Bu yıkama işlemi tekrarlayın ve Pelet % 3 350 µL içinde resuspend FBS/PBS.
8. Süspansiyon 7 tüpler içine her 50 µL süspansiyon içeren bölmek ve onları fluorophore Birleşik anti-CD81, anti-CD9 ve anti-CD63 antikorları ve karşılık gelen izotip denetimlerini kuluçkaya (1:10 seyreltme), sırasıyla 4 ° C'de 45 dk 1 tüplerinin günahı bir denetim, ancak aynı işlem gören olarak tutmak.
9. 3 FBS/PBS her tüp, 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak % 1 mL ekleyin.
10. Pelet 200-400 µL % 3 ile resuspend FBS/PBS ve akış sitometresi örneği analiz ( Tablo malzemelerigörmek) uygun kanallar altında.

7. eksozom morfoloji transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından karakterizasyonu

1. 10¹⁰ p/çözüm tespiti mL gibi uygun konsantrasyonlarda sulu dağıtıcıları ya tamir ( Tablo malzemelerigörmek) 15 dakika.
2. 300 üzerinde örnekleri karbon kaplama mesh yer ızgaraları bakır ve hava kuru bırakın.
3. Olumsuz örnekleri 0,22 µm filtre sulu uranyl asetat ile leke ( Tablo malzemelerigörmek) ( Tablo malzemelerigörmek) 4 min iki % 50 metanol/H₂tarafından O takip için yıkayın.
4. Hava kuru örnek.
5. TEM altında örnekleri gözlemlemek ( Tablo malzemelerigörmek). Hızlanan gerilim 80 küme kV ve spot boyut olarak 2. Objektif diyafram ile tüm örneklerini kullanın.

8. siRNA kapsülleme Exosomes Elektroporasyon tarafından içine

1. Elektroporasyon küvet önceden chill ( Tablo malzemelerigörmek) buz Elektroporasyon önce 30 dk için.
2. Mix 7.0 µg 0,33 µg siRNA (12 µL RNase free suda 2 µM stoktan) microcentrifuge tüp ile exosomes (7 x 10¹² p/mL stok PBS 32 µL) in. Sitrik asit tampon ile 150 µL sesini yapmak (bkz. Tablo malzeme). SiRNA molar oranı ya 1:60 Bu durumda olur.
3. Karışım Elektroporasyon küvet için transfer. Küvet kap ve electroporator küvet tutucu yerleştirin (bkz. Tablo malzeme). Dönüm tekerleği 180 ° saat yönünde döndürün.
   Not: Tekerlek ekseninde elektrotlar başvurun küvet için kilitli konuma tamamen açılması gerekir.
4. İstenen Elektroporasyon programı seçin (Örneğin, X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, vb) ve çoğalmasıyla Başlat düğmesine basıldığında başlayın.
   Not: Başarılı bir darbe "OK" ekranda göstererek gösterilir.
5. Bir kez electroporated, küvet tekerlek 180 ° saat yönünün tersine dönüş sonra kaldırın. Örnek için daha fazla alay plastik pipet ile küvet çekmek.

9. ücretsiz siRNA kullanma boyutu dışlama Kromatografi (sn) kaldırılması

1. SN sütun equilibrate (2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]; bkz: Malzemeler tablo) filtre uygulanmış PBS 3,5 mL iki kez geçirerek.
2. Filtre uygulanmış PBS 350 μL electroporated örneğinin 150 μL dağıtılması ve bu ücretsiz siRNA kaldırma işlemini gerçekleştirmek için sn sütuna aktarmak.
3. Eluted ilk 500 μL kesir sütundan (F0) toplamak.
4. Filtre uygulanmış PBS 500 μL sütununu ekleyin ve sonraki 500 μL kesir (F1) toplamak.
5. 10 x 500 μL kesirler (F9) en fazla toplam toplanan kadar yukarıdaki adımı yineleyin. F1 ve F2 siRNA kapsüllü exosomes bulunması gerekmektedir.
6. Sütun filtre uygulanmış PBS ile yıkayın (iki kez, en az) herhangi bir örnek artıkları kaldırmak için.

10. siRNA yüklü Exosomes PANC-1 hücrelere alımını Vitro

1. Tohum PANC-1 ( Tablo malzemelerigörmek) 24-şey düz-alt plaka alımı öncesinde de 24 h başına 50.000 hücre yoğunluğu, hücrelerde çalışma ve kuluçka (%5 CO₂, 37 ° C) hücreleri kuluçkaya.
2. Electroporate HEK-293 exosomes (7.0 μg) ile Atto655-siRNA (0.33 μg) göre Adım 8.
3. Electroporated ya adım 9 göre arındırmak ve PBS 100 μL içinde resuspend.
4. Electroporated exosomes 50 μL PANC-1 hücreye ekleme ve 37 ° C ve % 5 CO₂ 4 h için kuluçkaya.
5. Hücreleri kuluçka sonra toplamak.
6. 1 mL steril PBS hücrelerle yıkama ve PBS 200 μL polistren yuvarlak-alt resuspend ( Tablo malzemelerigörmek) tüp.
7. Hücreleri akış sitometresi tarafından analiz ( Tablo malzemelerigörmek) ile 10,000 olayları örnek satın aldı.
   Not: BM-electroporated ya-siRNA karışımı örnekleri ve filtre uygulanmış PBS ile tedavi edilmezse hücreleri denetimleri kullanılmıştır.

HEK-293 hücrelerden (HEK-293 Exo) izole exosomes fizikokimyasal karakterizasyonu Tablo 1' de özetlenmiştir. Analiz (NTA) araç izleme nanopartikül kullanarak ölçülen 107.0 ± 8.2 nm büyüklüğündeydi. Ya verim NTA enstrüman kullanılarak da analiz HEK-293 hücrelerden 6.99 ± 0,22 x 1012 p/mL ~ 24 mL (hasat 2 tur elde edilen) cm üzerinden yapıldı. Parçacık protein oranı (P:P) hesaplayarak değerlendirildi HEK-293 Exo saflığı 8.3 ± 1,7 × 1010 p/µg yapıldı.

İzole HEK-293 Exo boyutu dağılımı Şekil 3Aiçinde gösterilir. Morfolojik analiz transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak gösterdi HEK-293 Exo edildi küresel yapıları biraz 100 nm boyutunda (Şekil 3B). Bu sonuç bununla NTA ölçüm (Şekil 3A) kabul eder. İzole HEK-293 Exo CD81, CD9 ve CD63, veziküller exosomes (Şekil 3 c) tanımlamak için kullanılan kurallı işaretleri için olumlu.

Boyutu dışlama Kromatografi (Şekil 4) kullanarak exosomes arıtma için exosomes yüzde kurtarılması toplanan 10 kesirler (F0-F9) ilk eksozom ile Kurtarılan toplam eksozom parçacık sayısı bölünerek hesaplanır Parçacık numarası kullanılan, siRNA yüzde kurtarılması F3, F4 ve F5 toplanan tüm 10 kesirler elde edilen toplam floresan yoğunluğu ile elde edilen toplam floresan yoğunluğu bölünmesi ile hesaplanır. Kurtarma eksozom ve siRNA sonrası arıtma 75.0 ve % 80.4 anılan sıraya göre hesaplanmıştır. Exosomes siRNA kapsülleme verimliliğini ~ 10- , kurulan siRNA standart eğri (Şekil 4 c) kullanılarak hesaplanan yapıldı.

Floresan Atto655 siRNA ile akış sitometresi tarafından yüklenen exosomes alımını vitro kalitatif analiz siRNA kapsüllü exosomes ile tedavi PANC-1 hücreleri floresan sinyal (5A rakam) en büyük üst karakter kaydedilen gösterdi . SiRNA kapsüllü exosomes ile tedavi PANC-1 hücreleri nüfus olumlu gözlem ( yukarıda doğruladı boş exosomes ve siRNA karışım (%0.56) ile tedavi göre Atto655 sinyal (9.4) için daha yüksek bir yüzdesi kaydedildi Şekil 5B). SiRNA (Bu tedavi edilmeyen hücrelerin ortalama floresans yoğunluk (MFI) değerleri içinde kat fark olarak ifade) hücresel alımını derecesini de siRNA kapsüllü exosomes (MFI kat ile tedavi PANC-1 hücrelerdeki önemli ölçüde yüksek olduğu gözlenmiştir fark 5.1 =) eksozom-siRNA karışımı ile tedavi ile karşılaştırıldığında (MFI kat fark 1.1 =) (Şekil 5C). Bu gözlemler siRNA kapsüllü exosomes PANC-1 hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve onlar etkili siRNA intracellularly teslim olduğunu gösterdi.

Şekil 3: biyokimyasal ve morfoloji Analizi HEK-293 exosomes. (A)boyutu nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanarak HEK-293 exosomes dağılımı. Üst üste bir çubuk grafik 3 farklı standart sapma ölçümleri arasında ifade eden kırmızı bölgeler ile 30 s aralıklarla yakalar eğri gösterir (n = 3). (B) saf HEK-293 exosomes transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüler. Ölçek çubuğu: 100 nm. (C) algılama CD81, CD9 ve CD63 exosomal işaretlerinin akış sitometresi HEK-293 exosomes kullanarak. Exosomes aldehid/sülfat lateks boncuk algılama önce birleştiğinde. Boncuk eksozom kompleksi daha sonra anti-CD81, anti-CD9 ve anti-CD63 antikorlar fluorophore Birleşik lekeli. Derecesini ifade veri işaretleyicilerini kat farkı olarak medyan floresan yoğunluğu (MFI) değerleri bu denetimin (ile ilgili izotip lekeli boncuk eksozom kompleksi) ifade. Değerleri ifade ± SD, demek gibi burada n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: eksozom arıtma post-Elektroporasyon. (A)elüsyon profilleri (F0-F9) boyutu dışlama chormatography kullanarak Atto655-siRNA ve electroporated exosomes. Atto655-siRNA ve boyutu dışlama chormatography kullanarak eksozom F0 üzerinden F9 (B) NTA analizi. Atto655 (C) kalibrasyon eğrisi siRNA etiketli. Floresans yoğunluklarda plaka okuyucu tarafından elde edilen Ex / Em: 640-10/680 nm; 2800 kazanç. Değerleri ifade ± SD anlamına (n = 3). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: siRNA kapsüllü exosomes 4 h PANC-1 hücreleri içine hücresel alımını (A)çubuk grafikler boş exosomes + siRNA karışımı ve siRNA kapsüllü exosomes hücresel alımını karşılaştırma. (B) boş exosomes + 4 h yalancı Arsa tarafından karisimin siRNA alımını karşılaştırılması. Tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla (C) ortalama kat farkı floresan yoğunluğu (MFI) değerleri test örnekleri. Değerleri ifade ± SD, demek gibi burada n = 3. P < 0,001. NS: önemli değil. Tek yönlü ANOVA istatistiksel analiz için kullanıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Exosomes fizikokimyasal karakterizasyonu.

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.