Burada, bir kişi kabarcık bilayer yöntemiyle lipid bilayers oluşumu için bir iletişim kuralı mevcut. Mademki bir monolayer su-yağ arayüzü oluşan organik bir çözücü içine su balonu patladı. İki pipetler bir bilayer oluşturmak için ve baloncuklar sabitlemek için manipüle edilir.
Lipid bilayers iyon kanalları, kanal-membran etkileşimleri çeşitli membran altında incelenmesi lipit kompozisyonları sağlayan fonksiyonel çalışmalar için benzersiz bir deneysel platform sağlar. Bunlar arasında damlacık arabirimi bilayer popülerlik kazanmıştır; Ancak, büyük zar boyutu düşük elektrik arka plan gürültü kayıt engeller. Düzlemsel lipid bilayer avantajlarını birleştiren bir iletişim kabarcık bilayer (CBB) yöntemi ve lipid bileşimi değişir ve bilayer mekanik, sırasıyla işlemek olanağı gibi yama-kelepçe yöntemleri kurduk. Kurulumu geleneksel yama-kelepçe deneyler için kullanarak, deneyler CBB tabanlı kolayca gerçekleştirilebilir. Kısaca, bir cam pipet elektrolit çözümde bir organik çözücü faz (hexadecane) attı ve pipet basınç istikrarlı kabarcık boyutu elde etmek için korunur. Kabarcık kendiliğinden lipozomlar kabarcıkları üzerinden sağlanan bir lipid monolayer (saf yağlar veya karışık lipidler) ile kaplı olduğu. Daha sonra iki monolayer kaplı kabarcıklar (~ 50 µm çapında) Cam pipetler ucundaki bilayer oluşumu için yerleştirilmiş. Kanal yeniden düzenlendi lipozomlar giriş kabarcık içine bırakmak için tek kanallı geçerli kaydı bir sinyal-gürültü oranı ile yama-kelepçe kayıtları karşılaştırılabilir bilayer kanallarında birleşme yol açar. CBBs bir asimetrik lipid bileşimi ile kolayca meydana gelir. CBB art arda önceki kabarcıklar üfleme ve yenilerini şekillendirme yenilenir. (Örneğin, membran perfüzyon ve bilayer gerginlik) çeşitli kimyasal ve fiziksel tedirginlikler CBBs. İşbu üzerinde empoze edilebilir, biz temel yordamı CBB oluşumu için mevcut.
İyon kanalları, hücre zarının sadece destekleyici bir malzeme ama bir ortak iyon akı üretmek için değildir. İşlevsel olarak, membran hangi iyon kanalları katıştırılmış bir elektrik yalıtkan ve tüm hücre zarlarında istirahat membran potansiyeli ile öğretilir olmasıdır. Geleneksel olarak, rasgele bir membran potansiyel bir dış devre hangi kanallardan elektrik akımı ölçüldü getirilmedi. İyon akı farklı membran potansiyeli, bu kantitatif değerlendirilmesi iyon-seçici nüfuz ve gating işlevleri1,2gibi bu kanallar moleküler özelliklerini ortaya koymuştur. Membran için iyon kanallarının fonksiyonel çalışmalar hücre zarı veya lipid bilayer membran bir platformdur. Tarihsel olarak, tek kanallı elektrik geçerli kayıtları ilk lipid bilayers3,4‘ te gerçekleştirilen ve ilgili teknikleri (Şekil 1A yama-kelepçe yöntemi gibi hücre zarı için geliştirilmiştir )5,6. O zamandan beri bu iki teknik ayrı ayrı farklı amaçlar (Şekil 1)7,8için evrim geçirmiş.
Membran lipidler ve bilayer membranlar araştırma yapısı ve fonksiyonu kanal proteinlerin desteklemedeki rollerini için odak noktası şu anda vardır. Bu nedenle, hazır bilayers lipid bileşiminde değişir yöntemlerden yüksek talep olduğunu. Lipid bilayer oluşumu yöntemleri düzlemsel lipid bilayer (PLB)8,9,10,11, petrol su damlacığı bilayer12ve damlacık arabirimi bilayer (DIB)13, gibi 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 teknikleri (Şekil 1) altında lipit kompozisyonları20farklı kanal işlevi incelenmesi için bir fırsat sağlayan ortak seçeneklerdir. DIB geleneksel PLB üretmek Teknik olarak çok daha kolay olsa da, DIB büyük boy tek kanallı geçerli kayıtları her zamanki ölçekli gürültülerinden ile çalışmak için uygulamak yama-clampers için bir engel oluşturmuştur (< 100 pS).
Arka plan gürültü sorunu çözecek, bilayer alan indirilmelidir. Bu sorun tekrarlar için lipid bilayers (Şekil 1) elektrofizyolojik teknikleri gelişmekte olan tarihin hatırlıyor. İlk günlerde, bir pipet (İpucu daldırma yöntemi; ucunda bir küçük boyutlu bilayer (çapı 1-30 µm) kuruldu Resim 1 C) 21 , 22 , 23kullanmak yerine, bir müstakil bilayer (çapı ~ 100 µm) (resim 1B) bir odasında bir hidrofobik septum üzerinde. Çok alt arka plan gürültü24ile elektriksel ölçümler için izin ucu daldırma yöntemi. Tecrübelerimizi PLB25,26, ucu daldırma22,23,27ve yama-kelepçe28,29,30, 31 yöntemleri bize petrol su bilayer ilkeleri kullanarak lipid bilayers oluşturan bir fikir yol açtı. Bu kişi kabarcık bilayer (CBB) yöntemi20,32atıfta bulunmuşlardır. Bu yöntemde, petrol aşamasında (Şekil 1D), su damlaları asılı yerine su balonu Cam Pipet (ile uç çapı yaklaşık 30 µm) üzerinden petrol faz (Şekil 1E ve 2), nereye attı kabarcık sabit bir basınç uygulayarak korunur. Kabarcık bir monolayer formları kendiliğinden vasıl yüzey su-yağ arayüzey. Sonra iki kabarcıklar iki Cam pipetler manipülasyonu yerleştirilmiş ve iki monolayers, bir denge bilayer alanı verimli yaklaşım olarak bilayer oluşturulur. Kabarcık boyutu (basınç holding) içi-balon basıncı ve bilayer boyutu tarafından aynı şekilde denetlenir. Bir ortalama çapı 50 µm sık sık kullanılır. Kabarcık hacmi küçük olmasına rağmen (< 100 pL), toplu elektrolit faz oluşturan microliter aralığında pipet çözüm hacmin daha büyük bağlı.
CBB yöntemi (Tablo 1) kullanmak için birçok faydası vardır. Bir lipid bilayer oluşumu Teknik olarak çeşitli lipit kompozisyonları zarı üretilebilir ve daha geleneksel katlama yöntemi33tarafından asimetrik membran daha kolay kurulan32 vardır. Bilayer mekanik olarak, sadece bir hidrostatik basınç farkı34,35ile bükülebilir geleneksel PLB aksine manipüle edilebilir. Holding basıncı değiştirerek, baloncuklar genişletmek ya da daraltmak, artan veya azalan membran gerginlik-32önde gelen. Bilayer içine monolayers, membran morfolojik çalışmalarda, donma-kırık tekniği36,37 benzer mekanik olarak ayrılabilir ama CBB ile ayırma ve iliştirme döngüleri32 tekrarlanan bir manevra sağlar . Ve kanal kayıtları alma ihtimali çok geleneksel PLB tekniği ile daha yüksek kanal yeniden düzenlendi lipozomlar verimli füzyon bilayer içine küçük hacimli balonu içinde elektrolit çözüm sağlar. Küçük kabarcık birim aynı zamanda hızlı perfüzyon (içinde ~ 20 ms) bir kez başka bir enjeksiyon sağlar. pipet ya baloncuklar eklenir. Yama-kelepçe yöntemi, aksine kırık sonra bir CBB membran hemen ve art arda yeniden oluşturulur ve pipetler günde birkaç kez kullanılabilir. Yarar-in belgili tanımlık yama-kelepçe ve PLB yöntemleri entegre ederek, CBB membran, fizikokimyasal şartları değiştirmek için çok yönlü bir platform kanal-membran etkileşimleri benzeri görülmemiş çalışmaları için izin sağlar.
CBB oluşumu işleminin ayrıntılı bir protokol sunmadan önce bilayer oluşumu fizikokimyasal arka plan membran oluşumu ile ilgili deneysel zorlukları gidermek yama-clampers için yardımcı olacaktır ilk sunulur Bu karşılaşılmaktadır.
CBB deneyler yüzey kimyası bilim38dersleri vermek. CBB sabun köpüğü nerede aynı şekilde, bir su balonu organik bir çözücü attı havaya, pipet havaya benzer. Bir membran lipidler su balonu veya organik çözücü dahil değildir zaman su balonu pek şişirilmiş fark edeceksiniz. Amfipatik lipidler yokluğunda bir su-yağ arabirimi, yüzey gerilimi yüksek ve bir balon üfleme için Intra-balon basıncı yüksek olacaktır. Bu bir Laplace denklemi hayata geçirilmesidir (ΔP 2 γ/nerede ΔP içi-balon basıncı, γ olduğunu yüzey gerilimi ise R kabarcık yarıçapı R, =). Lipidler konsantrasyonu Organik faz veya elektrolit çözüm yüksek olduğunda, lipitler monolayer yoğunluğu, Gibbs adsorpsiyon İzoterm tarafından dikte edildiği gibi artar (-dγ = Γben yüzey aşırı nerede Γben dµben, Ben veben µ bileşiktir bileşen kimyasal potansiyel ben)39önde gelen bir alt yüzey gerilimi ve kabarcık oluşumu kolaylığı,. CBB bilayer bir teğet açı (Şekil 2) gözlenebilir ve ölçülebilir monolayer ve bilayer arasında iletişim açıdır. Bu açıyı monolayer surface tensions ve bilayer arasında bir denge ifade eder (genç denklem: γbı γmo cos(θ), nerede γbı var bilayer gerginlik, γmo monolayer gerilim ise θ temas açısı =). Monolayer gerginlik temas açısı değişikliklerden membran potansiyel bir fonksiyonu olarak değerlendirilir verilen bu değişiklikler bilayer gerginlik temas açısı değişimler gösterir (genç-Lippmann denklem: γmo = Cm V2 /4 (cos (θ0) – cos (θv)), nerede Cm şey zar kapasitans, V potansiyel membran ve θ0 ve θv 0 ve V mV, iletişim açılarla sırasıyla)40,41 ,42. İki kabarcıklar yeterince yakın olduğunda, onlar birbirlerini kendiliğinden yaklaşım. Bu van der Waals kuvvetleri nedeniyle ve görsel olarak CBB oluşumu dinamik bu süreçte gözlemleyebilirsiniz.
CBB sistem ayrı aşamadan oluşmaktadır: Yani, bir toplu petrol aşamasında, su kabarcıkları bir monolayer ve ekibine ulaşarak bilayer (Şekil 3) ile kaplı. Birden fazla aşama çözücü içeren simit bilayer faz ve bir ince organik faz tarafından iki monolayers43,44sandviç gibi bir PLB gözlenen anımsatan bunlar. CBB monolayer aşamasıdır bilayer broşür ile sürekli ve lipid molekülleri kolayca monolayer ve broşür arasında yaygın. Monolayer faz lipid su deposu olarak hizmet vermektedir büyük aşama oluşturan kabarcık yüzeyinin en kapsar. Çünkü monolayer lipidler hidrofobik kuyruğunun dışa toplu petrol aşamaya uzanır, bilayer iç veya hidrofobik çekirdeğin toplu petrol aşamaya açar. Böylece, bilayer yakın yağ fazına enjekte bir hidrofobik kolayca bilayer iç erişmeye devam edebilirsiniz bir maddedir. Son zamanlarda hangi bilayer lipid bileşiminde hızla (bir saniye içerisinde) tek kanallı geçerli kayıtları sırasında değiştirilir45, gelişen membran perfüzyon tekniğidir. Bilayer kolesterol içeriği geri dönülebilir olarak kolesterol perfüzyon ve45kapalı geçiş yaparak denetlenebilecek olduğunu bulduk. Monolayer ve bilayer ilgili madde konsantrasyonu farklı olay nedeniyle ilgili maddenin konsantrasyon gradyanı hemen Marangoni etkisi46, bilinen difüzyon tasfiye edilir 47. öte yandan, parmak arası terlik monolayers arasında yavaş48,49,50vardır.
CBB yöntemini kullanarak, bilayer 1 düşük bir elektrolit pH gibi çok yönlü fizikokimyasal koşullarda oluşturulur 51, 3 M kadar tuz (K+, Na+, vb) konsantrasyon, bir membran potansiyeli ±400 mV yüksek ve bir sistem ilâ 60 ° c sıcaklık
Orada CBB oluşumu için çeşitli seçenekler ve kanal moleküllerin birleşme orada. Su-yağ arayüzüne monolayer oluşumu için lipitler ya da organik bir çözücü (lipit-out yöntemi; eklenir Şekil 4 A, 4 C) veya bir kabarcık olarak lipozomlar (lipit-Yöntem; Şekil 4 B, 4 D). Özellikle, lipid Yöntem asimetrik membran15,32oluşumu için sağlar. Oysa kanal proteinlerin içine yeniden kanal molekülleri sulu çözüm (Örneğin, kanal oluşturmayan peptidler) çözünür doğrudan kabarcık (Şekil 4A, B)52,53, eklenir lipozomlar, o zaman (Şekil 4C, D) kabarcık eklenir. Burada, CBBs oluşumu için ya bir kanal peptid (polytheonamide B (pTB); lipid yöntemi ile Şekil 4 A) veya bir protein (KcsA Potasyum kanal, Şekil 4C) gösterilir.
CBB yöntemi lipid bilayer oluşumu monolayer20ile kaplı bir petrol su damlacığı prensibi temel alır. Teknik olarak, CBBs şekillendirme için kolay, özellikle yama-kelepçe araştırmacılar, cam Mikropipetler manipüle yetkin olan işlemlerdir. İki pipet manipülatörler microinjectors ile kullanılabilir olduğunda yama kelepçe için elektrofizyolojik Kurulumu kolayca CBB içinde kullanılır. CBB geleneksel PLB halefi olduğundan, öte yandan, fizikokimyasal bilgi büyük miktarda biri…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Mariko Yamatake ve Masako Takashima teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser desteklenmiştir kısmen KAKENHI tarafından grant 16 H 00759 ve 17 H 04017 (SO) numaraları.
Azolectin (L-α-Phosphatidylcholine, Type IV-S) | Sigma-Aldrich | P3644 | |
A/D Converter | Molecular Divices | Digidata1550A | |
Ag/AgCl electrode | Warner Instruments | 64-1317 | |
Bath Sonicator | Branson | M1800H-J | |
Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
Glass Capillary | Harvard Apparatus | 30-0062 | |
Hepes | Dojindo | 342-01375 | |
Hole Slideglass | Matsunami Glass | S339929 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX73 | |
Isolation Table | Herz | TDI-86LA(Y)2 | |
Micro Injenctor | Narishige | IM-11-2 | |
Micro Manipulator | Narishige | EMM | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micropipette holder | |||
n-Hexadecane | Nacalai | 07819-32 | |
Patch-Clamp Amplifier | HEKA | EPC800 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-87 | |
POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine ) |
Avanti Polar Lipids | 850757 | |
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) ) | Avanti Polar Lipids | 840457 | |
Potassium Chloride | Nacalai | 28514-75 | |
Rotary Evapolator | Iwaki | REN-1000 | |
Succinic Acid | Nacalai | 32402-05 | |
Vacuum Pump | Buchi | V-100 |