Uzun okunur dizileri büyük ölçüde karmaşık genleri ve yapısal değişim karakterizasyonu montajı kolaylaştırmak. Biz sıralama nanopore tabanlı platformlar tarafından olağanüstü uzun dizileri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşım kilobaz okuma orta kapsama ile yüzlerce insan hücreleri oluşturmak için değiştirilen kitaplığı hazırlıklar ardından en iyi duruma getirilmiş bir DNA ekstraksiyon benimser.
Üçüncü nesil tek molekül DNA sıralama teknolojileri artık bu önemli ölçüde teklif okuma karmaşık genleri ve karmaşık yapısal değişik analizini Meclisi kolaylaştırabilir uzunluğu. Nanopore platform tek molekül sıralama doğrudan gözenekleri geçitle DNA tarafından aracılı geçerli değişiklikleri ölçerek gerçekleştirmek ve kilobaz (kb) okuma en az sermaye maliyeti ile yüzlerce oluşturabilir. Bu platform için çeşitli uygulamalar birçok araştırmacılar tarafından kabul edilmiştir. Uzun sıralama okuma uzunlukları elde nanopore sıralama platformlar değerini kaldıraç için en önemli faktördür. Olağanüstü uzun okuma oluşturmak için özel dikkat DNA kırılmaları önlemek ve verimli sıralama şablonları oluşturmak için verimliliği elde etmek için gereklidir. Burada, biz ve bir nanopore aygıtında sıralama yüksek molekül ağırlıklı (HMW) DNA ekstraksiyon taze veya dondurulmuş hücrelerden, Kütüphane inşaat mekanik kesme veya transposase parçalanma, dahil olmak üzere olağanüstü uzun DNA sıralama detaylı Protokolü sağlar. 20-25 µg HMW DNA dan N50 90-100 KB okuma uzunluğu transposase ile parçalanma aracılı ve yöntem N50 okuma uzunluğu 50-70 KB mekanik kesme ile elde edebilirsiniz. İletişim kuralı tüm genom sıralama yapısal türevleri ve genom derleme tespiti için gerçekleştirmek için DNA memeli hücrelerinden çıkarılan uygulanabilir. DNA ekstraksiyon ve enzimatik reaksiyonları ek iyileştirmeler daha fazla okuma yüksekliğini arttırın ve yararını genişletin.
Son on yıl içinde kitlesel paralel ve son derece hassas ikinci nesil yüksek üretilen iş sıralama teknolojileri bir patlama Biyomedikal keşif ve teknolojik yenilik1,2,3tahrik var. Teknik gelişmeler rağmen ikinci nesil platformları tarafından oluşturulan veri kısa okuma karmaşık genomik bölgeleri çözümünde etkisiz ve hangi insan önemli rol oynarlar yapısal genomik türevleri (SVs), tespiti sınırlıdır Evrim ve hastalıklar4,5. Ayrıca, veri kısa okuma tekrarlama varyasyon gideremezseniz ve genetik varyantların6/ haplogrubundan phasing yüksek beklentileri karşılayan uygun olmayan.
Son tek molekül sıralama Teklifler önemli ölçüde uzun sürüyor okuma SVs7,8,9tam spektrum ve teklifler doğru ve eksiksiz derleme kompleks tespiti kolaylaştırabilir uzunluğu mikrobiyal ve memeli genleri6,10. Nanopore platformu doğrudan gözenekleri11,12,13geçitle DNA tarafından aracılı geçerli değişiklikleri ölçerek tek molekül sıralama gerçekleştirir. Herhangi bir varolan DNA sıralama kimya, nanopore sıralama uzun (on binlerce kilobases) okuma gerçek zamanlı polimeraz Kinetik güvenerek olmadan yapay içinde oluşturabileceğiniz veya amplifikasyon DNA örneği. Bu nedenle, nanopore uzun-(NLR-seq) tutan büyük söz özellikle düşük karmaşıklık veya tekrar-zengin Ultra uzun okuma uzunlukları büyük ölçüde genomik ve Biyomedikal analizleri14ilerlemek, 100 kb ötesinde oluşturmak için sıralama okuma genleri15bölgelerinde.
Özelliği nanopore sıralama, uzun oluşturmak için potansiyel bir teorik uzunluğu sınırlama olmaksızın okuyan yöntemdir. Bu nedenle, okuma uzunluğu DNA bütünlüğü ve sıralamanın şablon kalitesi ile doğrudan etkilenen DNA fiziksel uzunluğu bağlıdır. Ayrıca, manipülasyon ve adımları dahil, pipetting kuvvetler ve çıkarma koşulları gibi ölçüde bağlı olarak, DNA’ın kalite son derece değişkendir. Bu nedenle, bir uzun okuma sadece standart DNA ekstraksiyon protokolleri ve üretici sağlanan Kütüphane inşaat yöntemleri uygulayarak verim meydan okuyor. Bu amaçla doğru sağlam geliştirdiğimiz yöntemi olağanüstü uzun oluşturmak için hasat hücre çökeltilerini başlayarak sıralama veri (kilobases yüzlerce) okuyun. DNA ekstraksiyon ve Kütüphane hazırlama yordamları birden fazla iyileştirmeler evlat edindik. Biz DNA bozulması ve hasar neden gereksiz yordamlar dışlamak için protokol aerodinamik. Bu iletişim kuralı yüksek molekül ağırlığı (HMW) oluşan DNA ekstraksiyon, olağanüstü uzun DNA Kütüphane inşaat ve sıralama nanopore platformu üzerinde. İyi eğitimli bir moleküler biyolog, genellikle HMW DNA ekstraksiyon, 90 dakika veya kütüphane inşaat yamultma yöntemine bağlı olarak ve bir daha da 48 h DNA sıralama için en fazla 8 h tamamlanması için hasat hücreden 6 h alır. Protokolü’nün kullanılmasına genom karmaşıklık anlayışımızı geliştirmek ve insan hastalıkları genom varyasyon yeni bir anlayış kazanmak genomik topluluk güçlendirmek.
Prensip olarak, nanopore sıralama uzunluğu11,12,13megabase okuma için 100 kb oluşturmak yapabiliyor. Dört önemli faktörler sıralama çalışma ve veri kalitesi performansını etkiler: 1) etkin gözenek numaraları ve etkinliği ile gözenekleri; 2) motor protein, DNA nanopore geçerken hızını kontrol eder; 3) DNA şablonu (uzunluk, saflık, kalite, kitle); 4) giriş örnek kullanışlı DNA’dan belirleyen sıralaması bağdaştırıcısı ligasyonu verimlilik. İlk iki faktör akışı hücre ve üretici tarafından sağlanan sıralama kiti sürümü bağlıdır. Bu iletişim kuralı (HMW DNA ekstraksiyon, Yamultma ve tüp ligasyonu) kritik adımlarda ikinci iki faktörlerdir.
Bu iletişim kuralı uygulama ve sabır gerektirir. HMW DNA kalitesini olağanüstü uzun DNA kitaplıkları6için önemlidir. Protokol ile yüksek canlılık toplanan hücre ile başlar (> % 85 uygun hücre tercih), ölü hücreleri bozulmuş DNA’dan sınırlama. Tazminat (örneğin, güçlü rahatsız, sallayarak, girdap, birden çok pipetting, yinelenen dondurma ve çözme) DNA’yı tanıştırabilir miyim sert herhangi bir işlemde kaçınılmalıdır. Protokol tasarımında, DNA ekstraksiyon tüm sürecinde pipetting atlayın. Pipetting mekanik Kütüphane inşaat sırasında kesme ve sıralamanın sonra gerekli olduğunda kullanılacak geniş geçişli ipuçları gerekir. Nanopores odası arabellek12kimyaları duyarlı olduğundan, olmalı az kalıntı kirletici maddeler (örneğin, deterjanlar, yüzey aktif maddeleri, fenol, etanol, proteinler RNA’ların, vb) mümkün olduğunca DNA’sı. Uzunluğu ve verim göz önüne alındığında, fenol ayıklama yöntemi şimdiye kadar test birden çok farklı çıkarma yöntemleri ile karşılaştırıldığında en iyi ve en tekrarlanabilir sonuçlar gösterir.
Uzun okunur diziler üretmek için yetenek bu protokol rağmen hala bazı sınırlamaları kalır. İlk olarak, bu iletişim kuralını nanopore sıralama cihaz yayın sırasında kullanılabilir göre optimize edildi; Böylece, seçici nanopore tabanlı sıralama kimya sınırlıdır ve başka tür uzun okunur sıralama cihazların gerçekleştirildiğinde suboptimal olabilir. İkinci olarak, sonuç son derece başlangıç malzemeden (doku veya hücreleri) çıkarılan DNA kalitesine bağlıdır. Başlangıç DNA zaten bozulmuş veya bozuk okunur uzunluğu tehlikeye girer. Üçüncü olarak, her ne kadar birden fazla QC adım DNA kalite kontrol etmek için iletişim kuralında dahil edilmiştir, son verim ve uzunluğu, okuma akışı hücre tarafından etkilenebilir ve değişken nanopore sıralama platformu bu erken aşamada olabilir etkinlik, gözenek geliştirme.
Açıklanan protokol burada DNA ekstraksiyon için insan süspansiyon hücre satırı örnekleri kullanır. Kesme, HMW DNA oranı transposase ve açıklanan sonuçlar üretmek için ligasyonu zaman iğne geçen zamanlarda en iyi duruma. Protokol dört şekilde genişletilebilir. İlk olarak, kullanıcı-ebilmek başlamak ile kültürlü diğer memeli hücreleri ve hücre, doku, klinik örnekler veya diğer organizmaların farklı miktarda. Lizis kuluçka süresi, tepki birim ve Santrifüjü üzerinde daha fazla optimizasyon gerekli olacaktır. İkinci olarak, olağanüstü uzun okuma sıralama için hedef boyutunu tahmin etmek zordur. Okuma uzunlukları beklenenden daha kısa ise, kullanıcılar geçen zamanlarda mekanik kesme tabanlı yöntemi ayarlamak veya transposase transposase parçalanma tabanlı yöntemi için HMW DNA oranını değiştirin. HMW DNA çok yapışkan olduğundan daha uzun bağlama ve elüsyon zaman temizleme adımları sırasında yararlıdır. Üçüncü olarak, farklı nanopore sıralama cihazlar ile bir miktar ve birim DNA Sekanslama ölçütlerine ayarlayabilirsiniz. Dördüncü olarak, sadece sıralaması bağdaştırıcısı için bakmaksızın DNA sıralı. Tüp ligasyonu verimliliği daha da geliştirmek için bir bağdaştırıcı ve ligaz konsantrasyonları titre deneyebilirsiniz. Değiştirilmiş ligasyonu zaman ve moleküler kalabalık ajanlar PEG18 gibi gelecekte uygulanabilir. CRISPR19,20 ile birlikte olağanüstü uzun DNA sıralama iletişim kuralı hedef zenginleştirme sıralama için etkili bir araç sunabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Y. Zhu el yazması üzerine onun yorum için teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası P30CA034196 altında Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
Reagents | |||
Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Agencourt AMPure XPbeads | Beckman | A63881 | magnetic beads for cleanup |
BD conventional needles | Becton Dickinson | 305136 | 27G, for mechanical shearing |
BD Luer-Lok syringe | Becton Dickinson | 309628 | for mechanical shearing |
Blunt/TA Ligase Master Mix | NEB | M0367S | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | for cell counting |
EDTA | Invitrogen | AM9261 | pH 8.0, 0.5 M, 500 mL |
Flow Cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN106 | R9.4.1 |
HG00773 cells | Coriell Institute | HG00733 | cells used in this protocol |
Ligation Sequencing Kit 1D | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK108 | nanopore ligation kit |
MaXtract High Density tubes | Qiagen | 129073 | gel tubes |
NEBNext FFPE DNA Repair Mix | NEB | M6630S | |
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module | NEB | M7546S | |
Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
Phosphate-Buffered Saline, PBS | Gibco | 70011044 | 10X, pH 7.4 |
Phenol:chloroform:IAA | Invitrogen | AM9730 | |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | 20 mg/mL |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | fluorometer assays for DNA quantification |
Rapid Sequencing Kit | Oxford Nanopore Technologies | SQK-RAD004 | nanopore transposase kit |
RNase A | Qiagen | 19101 | 100 mg/mL |
SDS | Invitrogen | AM9822 | 10% (wt/vol) |
Sodium chloride solution | Invitrogen | AM9759 | 5.0 M |
TE buffer | Invitrogen | AM9849 | pH 8.0 |
Tris | Invitrogen | AM9856 | pH 8.0, 1 M |
Triton X-100 solution | Sigma-Aldrich | 93443 | ~10% |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Equipment | |||
Bio-Rad C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196EDU | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22628180 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | for cell counting |
DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | magnetic rack |
Eppendorf ThermoMixer | Eppendorf | 5382000023 | for incubation |
Freezer | LabRepCo | LHP-5-UFMB | |
GridION | Oxford Nanopore Technologies | GridION X5 | nanopore device used in this protocol |
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | rotator mixer |
MicroCentrifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-1000 | for UV reading |
Pippin Pulse | Sage Science | PPI0200 | pulsed-field gel electrophoresis instrument |
Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | fluorometer |
Refrigerator | LabRepCo | LABHP-5-URBSS | |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-A236 | |
Water bath | VWR | 89501-464 |