Nöronal uyarılabilirlik endo-dinamik bir süreçtir ve ekzositozu eksitatör ionotropic glutamat reseptörlerinin modülasyonlu. Burada açıklanan yüzey ve iç reseptör nüfus havuzları miktarının için erişilebilir, yüksek içerikli bir tahlil olduğunu.
Önemli bir mekanizma tarafından onların yanıt farklı uyaranlara karşı nöronların modüle postsinaptik hücre yüzeyine gelen ve reseptörlerinin kaçakçılığı. Sinaptik iletimde hızlı eksitatör nöronlar için sorumlu olan α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) reseptörleri, nöronal uyarılabilirlik dinamik olarak değiştirmek için postsinaptik yüzeye gelen ve insan ticareti. AMPA reseptör kaçakçılığı için sinaptik plastisite esastır ve nörolojik hastalığı bozdu. Ancak, tüm reseptör havuzları, reseptör kaçakçılığı miktarının için yaygın olarak karşılaşılan bazı yaklaşımlar göz ardı vardır aşırı zaman – ve emek yoğun, ya da potansiyel olarak normal ticareti mekanizmaları bozulur ve bu nedenle elde edilen verilerin yorumlanması karmaşık. Biz çift floresan immunolabeling ve yakın kızılötesi floresan 96-şey Mikroplaka tarayıcı kullanarak kültürlü birincil hipokampal nöronlarda bir yüksek-içerik tahlil yüzey ve iç AMPA reseptör nüfus miktar için mevcut. Bu yaklaşım sağlar internalized toplu hızlı tarama ve örnek malzeme en aza indirerek reseptör yoğunluğunu yüzey. Ancak, bizim yöntem tek hücreli çözünürlük elde etmek veya canlı hücre görüntüleme iletken sınırlamaları vardır. Son olarak, bu iletişim kuralı diğer reseptörleri ve farklı hücre tipleri, uygun ayarlamalar ve optimizasyon sağlanan mükellef olabilir.
Sorunun büyüklüğü ve nöronal uyarılabilirlik zamansal dinamiği bağlıdır büyük ölçüde kullanılabilirlik ve elektrokimyasal sinyalleri transduce yüzey reseptör nüfus bileşimi. Oysa yeni reseptörler (veya reseptör alt birimleri) sentezi genellikle bir enerjik pahalı ve nispeten uzun süren bir süreçtir, hücresel makine endo – ve varolan reseptörlerinin ekzositozu adanmış bir dizi sağlamak anlamına gelir onların hızlı ekleme için ve kaldırma için ve membran1. Bu nedenle, transkripsiyon ve çevirim reseptörlerinin yanı sıra, ardından reseptör kaçakçılığı nöronal uyarılabilirlik önemli bir modülatör düzenlemedir.
Sinaptik plastisite veya deneyim, nöronlar arasındaki bağlantılar değişen gücünü öğrenme ve bellek2,3temelini düşünülmektedir. Güçlendirilmesi ve uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen (LTP) ve uzun süreli depresyon (LTD) olarak adlandırdığı sinapslarda zaman içinde zayıflaması sırasıyla, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) reseptörleri kaçakçılığı yoluyla modülasyonlu 4 , 5. AMPA reseptör vardır dört alt birimleri (GluA1-4) oluşan heterotetramers ve beyin6hızlı eksitatör sinaptik iletimi çoğunluğu aracılık. Böylece, nöron uyarılabilirlik büyük ölçüde AMPA reseptör postsinaptik yüzeyi glutamat tarafından etkinleştirilmesi için kullanılabilir miktarı bir işlevdir. LTP ağırlıklı olarak AMPA reseptör ekzositozu bir artış ile ilişkilidir, ancak LTD sık AMPA reseptör endositoz, bir artış ile ilişkilidir. Endosomal teslim exocytotic proteinler, Füzyon plazma zarı ile o zaman bir kalsiyum-bağımlı bir şekilde7,8,9‘, oluştuğu için AMPA reseptörlerinin postsinaptik yüzey ifadesi gerektirir 10 , 11 , 12 , 13 , 14. bir dizi etkinlik bağımlı AMPA reseptör endositoz düzenleyen mekanizmalar da bulunmaktadır. Bunun bir örneği hemen erken gen yay/Arg3.1 (Arc) olduğunu. Diğer işlevleri15arasında Arc metabotropic glutamat reseptör (mGluR) arabuluculuk bilinmektedir-AMPA reseptör endositoz endositik proteinler AP-2, endophilin-3 ve dynamin-2 içerir bağlama ortakları aracılığıyla teşvik tarafından bağımlı LTD 16 , 17 , 18 , 19, clathrin kaplı,20,21çukurlar. İçselleştirilmiş AMPA reseptör plazma membran için geri dönüşümlü veya bozulma22,23için ayrılmış.
Önemlisi, AMPA reseptör alt birim bileşimi için ticareti kendi dinamikleri24katkıda bulunur. Büyük alaka ardından değişiklikler ve ticareti ile ilgili protein etkileşimleri çoğunluğu gerçekleştiği alanının alt birimleri, hücre içi C-terminal etki alanıdır. GluA1 ve GluA4 alt birimi içeren AMPA reseptör hücre yüzeyine LTP sırasında kısmen kendi PDZ ligandlar, çeşitli PDZ ile etkileşimleri ile ankraj membran teşvik ~ 90 amino asit dizileri varlığı nedeniyle insan ticareti için özellikle apt vardır etki alanını içeren protein25,26. Öte yandan, GluA2 içeren ve GluA1 veya GluA4 eksik AMPA reseptör yapısal insan ticareti ama intracellularly sinirsel aktivite27ile birikir eğilimindedir. GluA2 alt birimleri, endoplazmik retikulum28, saklama teşvik ek olarak kanal gözenek kalsiyum29, geçirimsiz işler düzenleme RNA daha fazla göstermek için alt birim özel anahtar bir arabulucu, nöronal kaçakçılığı geçmesi homeostasis ve plastisite. İlginçtir, Ubikuitin-bağımlı Arc bozulması bozulma GluA1 endositoz artırmak ve sonra ben mGluR agonist mGluR-LTD ile seçici indüksiyon grup GluA2 alt birimi içeren AMPA reseptör yüzey ifade artırmak için gösterilen (S) – 3,5 – Dihydroxyphenylglycine (çok mekanizmaları ve alt birim özel AMPA reseptör kaçakçılığı30rolü ile ilgili olarak öğrenilmesi gereken kalır gösteren DHPG).
Reseptörlerinin yüzey ifade değişimler gözlemleyerek yöntemleri çoğu kez hantal, zaman alıcı veya gereksiz tanıtmak zihnimi karıştıran. Biotin tabanlı deneyleri yaygın ve piyasada bulunan bir yaklaşım vardır. Ancak Elektroforez performans gerekliliği örnek malzeme büyük miktarda gerektirir ve birden fazla tedavi ile taranması aşırı derecede uzun işleyebilir benzeşme arıtma biotinylated yüzey reseptörlerinin böyle bir örnek temsil eder işlem31. Uzantıları nerede birden fazla zaman puan etiketleme ve immunoprecipitations ilk bir sinyal kademeli bozulması ölçmek için yapılmaktadır, bu testin benzer şekilde ihmal yanı sıra yeni — veya geri dönüşümlü — reseptörleri yüzey ve tek hücreye alevlenmesine zaman ve malzeme gereksinimleri.
Diğer yaklaşımlar chimeric yapıları kullanımı veya reseptör kaçakçılığı32gözlemlemek için floresan etiketler ekleme yapmak, bazen canlı kullanarak hücre görüntüleme33,34. Potansiyel olarak güçlü iken, bu tasarımlardan reseptörleri mutasyonlar veya molekül ağırlığı bu proteinler tanıttı dramatik değişiklikler nedeniyle normal kaçakçılığı şekillerinin etkileyebilir. Düşük pH34,35 hedefleyerek etiket hücre altı bölmeleri belirsiz ve farklı hücre içi bölmeleri reseptör ticareti (e.g. organellerin için önemli arasında ayrım yapmak boya kullanımı ve proteasomes) zor. Son olarak, trafiği ve potansiyel olarak yararlı ile belirli yerelleştirme içgörü sağlarken bozulması, endosomal proteinler veya clathrin, gibi ilişkili işaretçileri olan colocalization reseptörlerinin görselleştirmek için confocal mikroskobu kullanımı hücre altı çözünürlük, zaman, emek yoğun ve tek tek her hücre ve confocal şartı analiz gerekliliği nedeniyle pahalı veya Süper çözünürlük mikroskobu.
Burada, biz birincil nöronal kültür ürünleri30ile uyumlu olan bir yüksek-içerik reseptör kaçakçılığı tahlil göstermektedir. Bu yöntem sabit nöronların verilerin sunumunu normalleştirilmiş yüzey veya bu reseptör için genel yoğunluğu içselleştirilmiş reseptör yoğunluğu oranında olarak etkinleştirme, yüzey ve hücre içi reseptör havuzları ayrı olarak Etiketler. Bu yöntem yüksek içerik doğası birden fazla tedavi ve/veya genotip bir kısa süre içinde eleme için idealdir ve sadece standart hücre kültürü çalışmalarının ve antikor kuluçka uzmanlık gerektirir.
Kısaca, birincil nöronlar içinde standart 96-şey Mikroplaka yetiştirilen sonra deneysel tasarım tarafından dikte edildiği gibi tedavi, birincil antikorlar ile inkübe, yıkanmış ve sabit. Hücreler daha sonra başka bir fiksasyon adım gelir yüzey reseptörlerinin etiketlemek için ikincil bir antikor ile inkübe. O zaman permeabilization oluşur ve ikinci ikincil antikor iç reseptör havuzları etiketlemek için kullanılır. Son olarak, hücreleri entegre her reseptör nüfus yoğunluğunu ölçmek için bir kızılötesi Floresan Mikroplaka tarayıcı kullanarak yansıma. Şekil 1 bizim yüksek-içerik tahlil ile karşılaştırıldığında geleneksel biotinylation tahlil özetler.
İşte en iyi duruma getirilmiş ve birincil hipokampal nöron kültürlerde kaçakçılığı AMPA reseptör için belirli iletişim kuralı teklif ederken, bu yordamı, teorik olarak, olabilir genişletilmiş ve hücre tipleri çeşitli farklı reseptörleri için uyarlanmış.
AMPA reseptör kapsayan sinaps oluşumu, sinaps istikrar ve sinaptik plastisite nöronal işlevleri için ayrılmaz bir ionotropic glutamat reseptör alt türü vardır. AMPA reseptör bozulma için birden çok sinir hastalıkları24 bağlantılı ve çekici uyuşturucu hedefleri40olarak kabul edilir. Örneğin, çalışmalar bir Alzheimer hastalığı (Ah) erken işaretler synapse kaybı ve sinaptik AMPA reseptör düzeyleri41,42azalma göstermiştir. Çoğu intriguingly konularda, amiloid-β reaksiyonlar ilavesi yüzey GluA1 içeren AMPA reseptör ifade sinapslarda43bozar. Ayrıca, durum epileptikus aşağı-GluA2 mRNA ve hipokampal nöronların kendi ölüm44önceki protein düzenlemektedir. Amyotrofik lateral skleroz (ALS), TAR DNA’ya bağlanıcı protein (TDP-43) patoloji, bir ALS özgü moleküler anormallik, bağlantılı verimsiz GluA2 Q/R site-RNA45düzenleme.
Yüksek-içerik AMPA reseptör kaçakçılığı tahlil reseptör kaçakçılığı profilleri çok daha az zaman ve malzeme alternatif yöntemlere göre tüketen çeşitli faktörler cevaben nöronal ağından toplu değişiklikleri ölçmek için etkili bir yol sağlar. Tek bir 96-şey Mikroplaka birden fazla teknik çoğaltır ve aynı plaka farklı deneysel koşullar için denetimleri çalıştırmak için çok sayıda wells sağlar. 2 x 104 hücreleri/iyi göre 5 x 105 hücreleri/iyi yoğunluğu düşük kaplama yoğunluğu önemli ölçüde hayvanlar ve malzemeler her deneme (Şekil 1) için gerekli sayısını azaltır. Kızılötesi tarayıcı altı 96-şey Mikroplaka teker teker görüntü. Tahlil hangi tahlil elde etmek zordur ya da kültür (örneğin insan örnekleri ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler) pahalı olan değerli örnekleri üzerinde çalıştırırsanız, özellikle değerli hale gelir bir 384-şey Mikroplaka46için de değiştirilebilir. Tüm tahlil tamamlanmış ve değerli zaman (Şekil 1) kaydeder aynı gün analiz.
Tahlil başarılı ve verimli tamamlamak için bazı noktaları dikkate alınması gerekir. İlk olarak, DHPG çözüm nöron tedavi aynı gün hazırlamak önemlidir. Yeniden veya DHPG hisse senetleri dondurma değil. %4 paraformaldehyde/4% sükroz PBS çözümünde de deney aynı gün taze yapılmalıdır. İkinci olarak, denetim wells TTX ile sadece tedavi veya araç gözlenen etkileri tedavi için belirli olmasını sağlamak için gereklidir. Non-spesifik bağlama tarafından üretilen arka plan floresan için denetimine yalnızca ikincil antikorlar ile tedavi wells dahil etmek önemlidir. İkinci fiksasyon adım (ikincil antikorların aşağıdaki silinerek geçiş) anahtar ikincil antikor arka plan efektleri azaltılması ve etkili reseptör alt birimleri etiketleme ulaşmak olduğunu unutmayın.
Uzlaşma ve sınırlamalar, herhangi bir yöntemle gibi mevcut. Bu tahlil tek hücreli (veya hücre altı) çözünürlüğü sağlamaz ve gerçek zamanlı izleme gibi diğer yöntemleri32,33,35kaçakçılığı reseptör için izin vermez. Ayrıca, bu yöntem aşırı permeabilization durumunda hücre içi bileşenleri sızıntı için hassas olarak uygun bakım nöronlar, permeabilization adımı sırasında alınması gerekir.
The authors have nothing to disclose.
Zachary Allen teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Whitehall Vakfı (Grant 2017-05-35) tarafından desteklenen ve A.M.M. gökçek ve D.W.Y. Cleon C. Arrington araştırma başlatma hibe programı (teçhizat-93) her ikisi de Georgia State Üniversitesi Neurogenomics 2CI arkadaş grubu tarafından desteklenen.
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
(RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
B-27 Supplement (50 X), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | Cat#15710064 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |