Kullanım ve insan birincil prostat Organoid kültürü değerlendirilmesi

Organoids çalışma organogenesis ve hastalık için değerli bir araç vardır. Onlar hayvan modelleri için daha ucuz bir alternatif sağlamak ve hasta kaynaklı organoids Kişiselleştirilmiş tıp^1,2,3için bir strateji olarak gelişmektedir. Bu üç boyutlu (3D) kültür sistem (dokudan hasat veya pluripotent kök hücreler indüklenen) kök veya progenitör hücre tohum hücre dışı matriks bileşenleri (matris jel)⁴bir jel karıştırmak. Hücreler çoğalırlar ve ayırt etmek, hücresel hiyerarşi ve morfoloji faiz'ın işlevsel birim organ özetlemek organotypic yapılarda kaynaklanan. Organoids organlar, tükürük bezi, mide, bağırsak, karaciğer, prostat, akciğer ve beyin⁴de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklanan hücreleri kullanarak büyüdü. Prostat organoids^5,6kurmak için adımları açıklayan çok sayıda iletişim kuralları olmakla birlikte, organoids üzerinden nicel bitiş noktaları elde etmek yeterince ayrıntılı yöntemleri bulmak zordur. Bu kağıt insan birincil Prostat hücreleri için geliştirilmiş yöntemleri özetler ve organoid fenotipleri değerlendirmek için önerilen bitiş noktaları bir dizi detayları. Bu teknikler prostat organoids için optimize ve diğer 3D hücre kültürleri için olabilir.

Değerli vitro manken sınırlamalar kullanarak monolayer kültürlerin yoksun ölümsüzleştirdi hücre hatları belirlenen prostat organoid kültürler son zamanlarda ortaya çıkmıştır. İyi huylu prostat epiteli ve prostat kanseri ölümsüzleştirdi hücre hatları kullanarak modeli vitro için zor. İyi huylu hücre satır sayısı sınırlıdır ve tüm oncogenes⁷ile dönüşüm geçirmiş. Monolayers birincil prostat epitel hücrelerinde luminal hücrelere ayırt etmek ve androjen reseptörleri⁸eksikliği. Prostat kanseri hücre hatları çoğunluğu fonksiyonel androjen reseptörleri, erken hastalık durumu ve hasta tümörleri⁹' bulduğu eksikliği anahtar genetik değişiklikler önemli bir aracı yok. Prostat organoid kültür kolayca iyi huylu epitel yetiştirilir ve kök hücre özellikleri, progenitör hücreler, farklılaşma ve microenvironment^4,5deneysel değişikliklerin etkisini eğitimi değerlidir. Prostat kanseri organoids hassas tıp yaklaşımının bir parçası hasta hastalık ve tedaviler¹⁰yanıt modelleme için yetiştirilen olabilir.

Bu iletişim kuralını kullanan çeşitli hücre tiplerinin varolan iletişim kurallarından derlenmiş, ama burada insan birincil Prostat hücreleri kullanmak için optimize edilmiştir. Sawyers, Clevers, Shen tarafından belirlenen ve protokolleri övgü büyüme, passaging, parlak alan görüntüleme, dondurma ve prostat fare ve insan organoids RNA ve DNA izolasyonu tarif^5,6 . Bütün Dağı Protokolü Mahé vd değiştirilir Kim açıklar ve gastrointestinal epitel organoids kullanılan ¹¹, canlı görüntüleme ve donmuş ve katıştırma alkol. Borten vd. ¹² meme, kolon ve kolorektal kanser organoid morfoloji parlak alan görüntüleme üzerinden analiz nitelendirdi. Ayrıca, Richards ve ark. ¹³ prostat organoids morfolojik değerlendirilmesi için kullanılan bir yöntem. Son olarak, Hu vd. ¹⁴ yapışan prostat organoids odası slayda immünfloresan tek hücreleri ve küreler Akış Sitometresi Analizi için dispersiyon gözlemlemek için boyama önce gecede bir yöntemi açıklanmıştır.

Bu iletişim kuralı, yeterince ayrıntılı bir biçimde bu teknik olarak zor yöntemleri hücre tohum da dahil olmak üzere, bir iletişim kuralı olarak göstermek için hedeftir; Medya ve matris bakım Jeli; Akış Sitometresi için hücreler topluluğu; RNA, DNA ve protein ayıklama; morfolojik değerlendirmesi alan parlak z-yığın çözümlemesi; Gömme, işleme ve histolojik boyama için kesit; ve bütün-montaj ayirt veya floresan sonda deneyleri için. Biyolojik alaka ve bu çeşitli bitiş noktaları yorumlanması deneysel tasarım ve analiz için antikorlar arasında değişir. Bu iletişim kuralı kullanımı, kullanıcılar bir deney bitiş noktaları toolkit ile kurmak hazır hissetmeniz gerekir.

İnsan birincil prostat epitel (PrE) hücreler laboratuarda Peehl^15,16 tarafından açıklanan ve sınırlı sayıda pasajlar (en çok dört) yukarıda açıklanan¹⁷olarak tutulan protokolü tarafından kuruldu, ama onlar da ticari satıcılardan temin edilir. Hepatosit serum-özgür medya tabanlı⁶,¹³KSFM tabanlı ve R-spondin⁵ 1 şartına medya tüm başarılı organoids üretilen olarak yayımlanır. Burada anlatılan KSFM tabanlı katkı maddeleri, en az sayıda gerektirir.

Aşağıdaki iletişim kuralı kullanarak insan birincil prostat epitel hücreleri, Illinois Universitesi, Chicago hastanesinde hasta dokusundan hasat optimize edildi. Bu deneyler için kullanılan tüm insan doku Protokolü edinsel üzerinden bir Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanan ve/veya muafiyet Chicago Illinois Üniversitesi'nde olduğunu. Kültür koşulları faiz hücre türüne bağlı olarak değişir iken, bitiş noktaları için diğer dokuların organoids uygulanabilir.

1. tohum epitel hücrelerinin matris jel ve Medya değiştirme

1. Gerekli malzemeleri toplamak: insan birincil prostat epitel hücreleri (PrE), matris jel buz, 96-şey Mikroplaka, keratinosit serum-ücretsiz medya (KSFM) buz üzerinde kömür soyulmuş fetal Sığır serum (FBS) ve dihidrotestosteron (DHT).
2. Organoid KSFM tabanlı medya KSFM 47,5 mL kömür soyulmuş FBS ve dihidrotestosteron (DHT) 2.5 mL ile birleştirerek buz son yandan 10 nM DHT, daha sonra rezerv için hazır olun.
3. Plaka hücrelere bir 3D matris steril tekniği kullanarak bir hücre kültür Hood.
   1. Yavaşça KSFM tabanlı organoid medya ile % 50 matris elde etmek için buz gibi matris jel karışımı yavaş yavaş jel karışımı soğuk yukarı ve aşağı pipetting, kabarcıklar kaçınarak.
      Not: Matris jel gecede 4 ° C'de çözdürülen ve buza mümkün olan her durumda tutulması gerekir. Hızlı bir şekilde oda sıcaklığında (RT) dönüşür.
   2. % 50 matris μL jel bir 96-şey plaka üzerinde kullanılmak üzere her şey alt üzerine bir pipet ucu soğuk medya ve transfer 40-50 önceden ıslak. Temel katman oluşturmak üzere kuyunun kat.
      Not: Bu kabarcıklar oluşturabildiğiniz gibi tam olarak ikinci durağına pipet üzerinde dağıtmak değil.
   3. 96-şey plaka 37 ° C kuluçka temel katmanın kuvvetlendirmek 30-45 dakika yerleştirin.
      Not: temel katmanın üzerine epitel hücreleri katılaşmış veya hücreleri aracılığıyla matris alt plaka üzerine düşmek ve bir monolayer büyümek kadar plaka değil.
   4. Epitel hücreleri organoid KSFM tabanlı medya 100 – 1000 hücre/100 μL son bir konsantrasyon ulaşmak için matris jel ve % 33 matris jeli askıya karıştırın. Üstünde tepe-in temel katmanları iyi 100 μL % 33 matris jel/hücre karışımı kullanarak plaka epitel hücreleri.
      Not: Önceki deneyler göstermiştir ki tohum çok seyrek çok düşük verim¹³' te neden olabilir iken epitel hücrelerinde çok yoğun 3D tohum organoid büyüme, boyutunu sınırlar. Hücre tipi hastaya özgü organoid oluşumu verimliliği üzerinde temel ilgi için tohum koşulları optimize etmek önemlidir.
4. 30-45 dk kuvvetlendirmek matris jel izin vermek için 37 ° C kuluçka 96-şey plaka yeri, sonra yavaşça yavaşça kuyu kenarına dayanmalıdır pipetting tarafından 100 μL KSFM tabanlı organoid medya hücreleri üzerine ekleyin.
5. Medya her 2-3 gün değiştirin. İyi tarafı karşı pipetting medya ve matris jel arasında boşluk ile dikkatli bir şekilde medya 50 μL kaldırın ve taze medya 50 μL ile değiştirin.
   Not: uzun vadeli bir kültür için matris jel her 2-3 hafta değiştirilmesi gerekiyor. Matris jel kültür dengesiz görünür ve mikroskop altında yarı saydam kırışıklıkları görüntüler, matris jel bozuldu ve değiştirilmesi gerekir.

2. Organoids Matrix jel üzerinden toplanması

Not: Organoids topluluğu matris jel değişiklikleri, passaging veya RNA ayıklama, DNA ekstraksiyon, protein çıkarma ve akış sitometresi bitiş noktaları için gereklidir.

1. Sıcak tarafsız proteaz ve Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 37 ° C su banyosu içinde.
2. Dikkatli bir şekilde medya kuyulardan matris jel aksatmadan çıkarın.
3. ~ 200 μL tarafsız proteaz olan her şey için bir ~ 1 ekleyin: matris jel: tarafsız proteaz 2 oranı ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
4. Mekanik matris jel: tarafsız proteaz karışımı yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak.
5. 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya
6. Tarafsız proteaz-matris hücre içi jel karışımı bir microcentrifuge tüp ya da hacmine bağlı olarak konik tüp aktarın. 300 x g hücreleri cips için 3-5 dakika için de santrifüj kapasitesi.
   Not: hiçbir hücre Pelet görüntülenirse, matris jel değil tamamen ayrışmış ve pembe süpernatant ayrı tüp alt yarı saydam bir aşama olarak görüntülenir. Süpernatant kaldırmak ve daha tarafsız proteaz bir 1:2 oranında matris için jel Pelet ekleyin, başka bir 20-40 dk 37 ° C'de için kuluçkaya ve 300 x gde aralıklarla tekrar.
7. Bir organoid Pelet alındığında süpernatant kaldırın. (Bkz. Adım 2.7.1), organoid lizis RNA, DNA veya protein çıkarılması için passaging ile devam edin (bkz. Adım 2.7.2), işlem tek hücreleri akış sitometresi ve tek hücreli sıralama tarafından (bkz. Adım 2.7.3).
   1. Uzun vadeli kültür için 1,1-1,5 adımlarda açıklanan adımları izleyerek % 33 taze matris jel ve plaka sağlam organoids yavaşça resuspend. Organoids ayırmak ve tek hücre olarak replate, pelet 1 mL sıcak hücre-ayrılma enzimlerin resuspend ve 10-15 dk 37 ° C'de kuluçkaya için bir kez HBSS 5 mL ile yıkayın ve aşağıdaki adımları 1,1-1,5 taze matris jel içinde yeniden plakası.
   2. Malzemeleri tabloda listelendiği gibi uygun lizis arabelleği RNA ayıklama, DNA ekstraksiyon veya protein çıkarma organoid Pelet resuspend ve üreticinin iletişim kuralı izleyin.
   3. 1 mL sıcak hücre-ayrılma enzimlerin organoids resuspend ve 10-15 dk organoids tek kişilik hücrelere ayırmak için 37 ° C'de kuluçkaya. Bir kez HBSS 5 mL ile yıkayın ve akış sitometresi⁵ veya tek hücre sıralama¹⁸için protokol ile devam edin.
      Not: matris jel düşük konsantrasyonlarda tek hücreye ayırmak için tarafsız proteaz değil gerekli olabilir ve hücre-ayrılma enzimler doğrudan kuyuya adım 2.2 sonra uygulanabilir.

3. bütün şey resim alma ve Organoid morfoloji Analizi

1. Bütün iyi z-yığın görüntüleri iletilen ışık ters mikroskop ile motorlu kullanarak X / Y sahne ( Şekil 1A' resimli iş akışı) tarama.
   1. Kuyunun için ayarlanabilir odak konumu ile ilk organoid, temel katmanın üzerinden menisküs nedeniyle kuyunun Center'da olacak karşılaşılana kadar yukarı doğru odaklanarak başlar. Alt z-uçak bu konumda ayarlayın.
   2. Son organoid iyi çevre-ecek var olmak odak kadar yukarı doğru odaklanarak devam edin. En iyi z-uçak bu konumda ayarlayın.
      Not: z yığının altında ve üst ayarladıktan sonra bu pozisyonlar organoids tüm kalan kuyu içinde yakalamak ve üst/alt gerektiği gibi ayarlamak emin olun. Bu her organoid her şey içinde içeren tek bir tarama için kullanılacak z aralığı sağlar.
   3. 15-35 z-uçak başına iyi, daha fazla çözümleme için daha büyük bir sayı kullanarak yakalama. Tüm iyi görüntü yakalama, birleştirme ve gerekirse çeyrek daire veya alt toplamak.
      Not: Birden çok z-düzlem olarak karşı tek bir z-uçak, organoids odak dışında tek bir z-uçak yakalarken olan Şekil 1B adımında gösterildiği gibi almak için önerilir.
   4. Aşağı akım analiz için z-yığın görüntü kaydedin.
2. Serbest form çizim yetenekleri ile görüntü yazılımı kullanarak görüntüleri analiz.
   1. Adım 3.1.4 ayarlayın tek bir z-uçak görüntüyü açın.
   2. Gerekirse, tek tek her z-uçakta bir tek, Bütün-da görüntü içine çekilen görüntüler döşeme. Yeni resmi ayrı bir dosya olarak kaydedin. Alınan her z-uçak için bu işlemi yineleyin.
   3. Görüntü yazılımı kullanarak, tek bir kuyudan her z-uçak için bütün iyi görüntü açın ve genişletilmiş bir alan (EDF) görüntü derinliği z-uçak yığından oluşturun.
      Not: Bu tür bir görüntü iyi tek bir odakta görüntü oluşturmak için her z uçak en iyi odak bölgenin seçecektir.
   4. Yazılım piksel ölçeğini ölçülür görüntü ölçek çubuğu ayarlayın.
   5. Görüntü yazılımı izleme çevre her organoid iyi ve serbest form çizim aracını kullanarak.
   6. İzlenen organoid parametreleri için ölçüm metrikleri görüntü yazılımı'nı edinebilirler.
      Not: Önerilen alan, Döngüsellik ve maksimum/minimum RADIUS oranı parametreleridir. Bu ölçümler uygulanması gösteren temsilcisi sonuçları Şekil 1 ciçinde gösterilir. Alan organoid'ın çevre tarafından tanımlanan Çokgen hesaplanır. Ürün reçetesinde döngü için 0 daha az dairesel, 1 daha dairesel çapı eşit bir organoid'ın en büyük gelincik, olan bir daire alanı organoid alanı oranıdır. Maksimum yarıçapı ve izlenen organoid en az yarıçapı arasındaki oran maksimum/minimum RADIUS oranıdır.
      Ürün reçetesinde döngü =
      RADIUS oranı =

4. formalin fiksasyon ve parafin Organoids histolojik bitiş noktaları katıştırma

1. Gömme malzemeleri hazırlamak: HBSS, %2 agar çözüm, histolojik işaretleme boya, Histoloji jel, pipet ucu kalıp, teyp, pistonu 1 cc insülin şırınga, buz torbası, kaset, % 10 tarafsız tampon formalin (NBF), kalem ve % 75 histolojik grade etanol (alkol).
   1. %2 agar çözüm iki microcentrifuge Tüp hazırlayın. Bir su banyosu veya 100-110 ° C agar sıvı formda korumak için bir ısı blok üzerinde kuluçkaya. 1-2 damla histolojik boya agar üst göstermek %2 agar çözümlerden birini için işaretleme takın ve yönlendirme katıştırma sırasında korumada yardımcı ekleyin. İyice karıştırın.
   2. Sıcak su banyosu veya ısı blok 55-65 ° C'de Histoloji jel
   3. 1000 μL pipet ucu kullanarak, ~ 50 μL tutan bir silindir yapmak pipet ucu küçük bir bölümünü keserek kalıpları oluşturmak. İlk kalıp uygun ikinci, daha geniş bir kalıp oluşturun.
   4. Soğuk bir blok buz torbası bandı (yapışkan tarafı yukarı) ile kaydırma ve kalıpları teybe kalarak oluşturun.
   5. Bir dalgıç pompayı 1 cc insülin şırıngadan kaldırarak oluşturun.
2. Organoids 2A rakamtasvir iş akışı aşağıdaki işlem, Histoloji jel fiş katıştırın.
   1. Matris jel ayırmak ve adımları 2.1-2.7 takip ederek organoids cips.
   2. Bir kez HBSS ve yeniden cips 1 mL ile organoid Pelet 300 x g de 3-5 dk iplik ve süpernatant kaldırma yıkayın.
   3. Organoid Pelet sıvı Histoloji jel 30 – 50 μL içinde yeniden askıya alma. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı yavaş yavaş pipetting. Histoloji jel/organoid karışımı bir kalıp içine soğuk blokta aktarmak ve serin ve bir'liğe kuvvetlendirmek numune izin.
   4. Bir dalgıç tak küçük kalıp dışarı ve daha büyük kalıp içine itmek için kullanırız. NET %2 agar büyük kalıp doldurmak için fiş çevresinde pipet.
   5. Histolojik boya renkli %2 agar üst örnek belirtmek için fiş üzerine pipet.
   6. Soğutmalı sonra bir dalgıç fişi Histoloji kaset aktarmak için kullanabilirsiniz. Bir kalem ve yer kaset % 10 kullanarak kaset etiket NBF gecede fiksasyon için.
   7. Kaset % 10 dan transfer NBF % 70 histolojik Grade alkol.
5. 3. 
      
   6. 
      
   7. 
      
   8. 
      
7. &
   
   1. &

İnsan birincil prostat organoids başarılı kültürü, Morfoloji ve farklılaşma alan parlak görüntü analizi ve FFPE ve bütün Dağı boyama teknikleri kullanılarak değerlendirilebilir.

Şekil 1A' alan parlak görüntü yakalama işlemi gösterilmektedir. Organoids 3D dizey içinde büyüdü ve farklı odak uçaklar arasında dağınık. Organoids odak birçok uçak gözlemlemek için EDF görüntüyü (Şekil 1B, sağ) tek bir z-uçağı yerine (1B rakam, sol) kullanmak için önerilmektedir. Laboratuarda, farklı deneysel koşullar altında yetiştirilen organoids morfoloji değişiklikler neden olabilir. Alan, (ne kadar benzer organoid bir daireye tarafından tanımlanır) Döngüsellik ve max/min yarıçap (uzunluk ölçüsü) kullanılması kullanıcılar organoid boyut ve şekilde bir göstergesidir ve morfoloji ölçülebilir bir okuma sağlar. Bu önlemlerin kullanışlılığı vurgulamak için organoids ile benzer alan ama farklı morfoloji temsilcisi görüntüleri hangi uzun bir organoid daha az dairesel ve daha büyük bir maksimum/minimum oranı daha küresel bir Şekil 1 c, gösterilir organoid.

Organoids Histoloji için gömme örnekleri iç gözlemlemek ve bu nekroz bir organoid çekirdek içinde mevcut değil emin olmak için yararlı bir bitiş noktası olur. Bir iş akışı için bu işlem ve alan parlak mikroskop altında günahı, kesitli örneklerinin temsilcisi sonuçları Şekil 2AB, Ctemin edilmektedir. Şekil 3A düzgün göre (solda) mishandled bir organoid organoids Şekil 3A (sağda) ve Şekil 3Bteslim gösterir. Örnek ayırt etme durumunu belirlemek için bazal hücre işaretleri (cytokeratin 5 ve p63)8 luminal hücre işaretleri (cytokeratin 8)8ile birlikte bakmak için önerilir. Organoids leke istenirse in situ, Bütün-mount boyama uygun bir alternatiftir ve temsilcisi bu sonuçları Şekil 3 cö. sağlanır

Şekil 1: organoids 3D kültür morfoloji değerlendirme. (A) resim koleksiyonu ve sıkıştırma iş akışı insan birincil prostat organoids tarafından iletilen bir ışık elde için ters bir motorlu mikroskopla X / Y sahne ve arkadaşı yazılım tarama. (B) temsilcisi görüntüleri tek z-stack (sol) vs. EDF görüntüsünü (sağda) birden çok z yığınlarının tek bir görüntü birleştirildiğinde daha fazla organoids odakta olduğunuzu gösteren insan birincil prostat organoids bütün iyi örneği (ölçek çubuğu = 1000 µm). (C) temsilcisi görüntüler için aynı bölgede olan morfolojik birbirine benzemeyen insan birincil prostat organoids alanı, Döngüsellik ve max/min oranını (ölçek çubuğu 200 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: iş akışı ve sonuçları kesit temsilcisi katılmasını Organoid. (A) insan birincil prostat organoid iş akışı katıştırma. (B) temsilcisi agar (yeşil ok), Histoloji jel (siyah ok), kabarcık (mavi ok), organoids (kırmızı oklar) gösteren bir parlak alan mikroskop altında insan birincil prostat organoids içeren bir günahı, taze slayt görüntüsünü (ölçek çubuğu = 1000 µ m). (C) taze kesilmiş slayt (solda) vsgünahı. günahı kuru slayt (sağda), organoids (kırmızı oklar) saydam ne zaman kuru görünür (ölçek çubuğu = 500 µm) ve alan parlak mikroskop altında ayırt etmek zordur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: histolojik kesitli ve bütün monte organoids üzerinde boyama. (A) (agresif pipetting, yanlış işlem protokolü, sol) (sağ) iyi işlenmiş bir organoid yanında ilgilenmedikleri üzerinden bir kırık insan birincil prostat organoid, H & E boyama (ölçek çubuğu = 100 µm). (B) formalin sabit, parafin-gömülü, olmuştur insan birincil prostat organoid kesitli ve bazal cytokeratin 5 veya luminal cytokeratin ile 8 (üst) veya bazal p63 ve luminal cytokeratin 8 (alt) lekeli ve yansıma confocal mikroskop () ile ölçek çubuğu = 100 µm). (C) bir bütün monte edilmiş insan birincil prostat organoid bazal cytokeratin 5 veya luminal cytokeratin 8 ile lekeli ve phalloidin ve confocal mikroskopla görüntüsü DAPI, counterstained (ölçek çubuğu = 100 µm). (D) ile fluorescently lekeli bir insan birincil prostat hücre bütün monte organoid EdU etiketli ve karşı Hoescht, confocal mikroskopla görüntüsü ile lekeli (ölçek çubuğu 500 µm =) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Yazarlar ifşa gerek yok.