Özet

Oksijen tüketim oranını bir hücre dışı akı Analyzer kullanarak birincil kültürlü fare yenidoğan Cardiomyocytes içinde analiz

Published: February 13, 2019
doi:

Özet

Bu iletişim kuralının amacı fare yenidoğan cardiomyocytes bir modeli sistemi olarak nasıl çeşitli faktörler oksijen tüketimi kalp değiştirebilirsiniz incelemek için nasıl kullanılacağını göstermektir.

Abstract

Mitokondri ve oksidatif metabolizma kalp kası fonksiyonu korumak için önemlidir. Araştırmalar bu mitokondrial disfonksiyon kalp yetmezliği bulunan Engelli kardiyak fonksiyon için önemli bir faktör olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, arızalı mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kalbinde kardiyak fonksiyon geliştirmek için yararlı etkileri olabilir. Bu nedenle, düzenleyici mekanizmaları eğitim ve Roman düzenleyiciler, mitokondriyal işlev için tanımlama kalp hastalığı tedavisi için yeni tedavi hedefleri geliştirmek için kullanılan fikir sağlayabilir. Burada, kardiyak myocyte mitokondrial solunum benzersiz hücre kültür sistemi kullanılarak analiz edilir. İlk olarak, bir protokol hızla yalıtmak ve yüksek canlılık yenidoğan fare cardiomyocytes kültür için optimize edilmiştir. Daha sonra bir 96-iyi biçim hücre dışı akı analyzer bu cardiomyocytes oksijen tüketim hızı değerlendirmek için kullanılır. Bu iletişim kuralı için koşullar tohum en iyi duruma getirilmiş ve o yenidoğan fare cardiomyocytes oksijen tüketim oranını kolayca bir hücre dışı akı Çözümleyicisi’nde tespit edilebilir gösterdi. Son olarak, biz daha büyük bir kültür boyutu bizim iletişim kuralı uygulanabilir ve diğer çalışmalar, contractile ve hücre içi sinyal gibi analiz çalışması unutmayın.

Introduction

Sürekli kardiyak contractile işlevini sürdürebilmek için cardiomyocytes hücresel enerji ATP1şeklinde öncelikle sürekli bir tedarik korumak gerekir. Kalbinden, ATP yaklaşık % 95’i mitokondri, Oksidatif fosforilasyon, mitokondri kardiyak fonksiyon2,3‘ te çok önemli bir Biyo-enerjetik rol oynamak gösterilen üzerinden olmak üzere oluşturulur. Bu fikri destekleyen olduğunu mitokondriyal işlev bozukluk kardiyomiyopati ve kalp yetmezliği4,5‘ e neden olabilir. Diğer taraftan, mitokondriyal işlev geri yükleme başarısız kardiyak fonksiyon geliştirmek için gösterilmiştir kalp6,7. Bu nedenle, mitokondriyal bioenergetics mekanizması eğitim ve mitokondrial fonksiyonunu kullanabilirsiniz cardiomyocytes roman düzenleyiciler belirlenmesi sadece kalp enerji üretim mekanik anlayışlar ortaya değil ama ayrıca yol açacak fikir sağlayabilir kalp hastalıkları6,8tedavisi için yeni tedavi hedefleri gelişimi için.

Tüm kalp için karşılaştırıldığında, hangi miyositler ve sigara miyositler9, cardiomyocyte kültürlerin karışımı içeren son derece saf, yürekten, fibroblastlar ve endotel hücreleri10gibi miyositler en az kirlenme ile. Buna ek olarak, cardiomyocytes yenidoğan pups dan izole zaman, Yetişkin kalpler10,11‘ den izole hücrelere kıyasla küçük bir miktarda çok sayıda hücre kültürü çalışmalarının sağlar. En önemlisi, birincil kültürlü yetişkin fare cardiomyocytes (örneğin 24 h) kez kısa hayatta kalma var ve de-puan daha uzun zaman ayırmak. Yenidoğan fare cardiomyocytes yaşayabilir ve yukarı 7 gün içinde kültür, onları cardiomyocytes10dakika sonra uyuşturucu bileşikler ve mitokondri gen düzenleme fonksiyonları üzerine etkilerini test etmek için idealdir için manipüle edilebilir. Tabii ki, Yetişkin ve neonatal hücreler arasında önemli biyolojik farklılıklar vardır, ama yenidoğan hücre kültürü için daha uzun süre onları çalışmalar, mitokondriyal işlev de dahil olmak üzere birçok farklı türleri için uygun hale getirir.

Bugüne kadar birincil kültürlü yenidoğan fare ve sıçan cardiomyocytes model olarak kardiyak bioenergetics12,13eğitim için kullanılmaktadır. Son yıllarda çalışmalar bir hücre dışı akı analizörü oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek ve fare ve sıçan yenidoğan cardiomyocytes14,15dakika sonra oksidatif kapasite değerlendirmek için kullanılır. Fareler için karşılaştırıldığında, fare yenidoğan cardiomyocytes hücre canlılığı düşüktür ve büyük değişkenlik16vardır. Ayrıca, hücre genetiği fare modelleri arasında çalışma olanağı fare hücre modeli çok önemli yapar. OCR çalışmalar hücre sayısı ve yoğunluğu tohum kadar hassas olduğunu göz önüne alındığında, tutarlı hücre verim ve canlılık elde etmek için tekrarlanabilir, güvenilir ve basit bir iletişim kuralı geliştirilmesi gereklidir.

Burada, kültürlü fare yenidoğan cardiomyocytes 96-iyi format hücre dışı akı analyzer ile birlikte OCR analiz için kullanan geliştirilmiştir bir en iyi duruma getirilmiş protokol raporu. Bu iletişim kuralı büyük tekrarlanabilirlik testin artırır. Ayrıca, protokol sadece bir roman ve OCR analiz için tekrarlanabilir yöntemi sağlar, ama aynı zamanda daha büyük bir boyut kültür ve hücre içi myofibrillar fonksiyonlar çalışma için gerekli olabilen bu gibi diğer Deneysel amaçlar için adapte Sinyal yollar.

Özellikle, bu iletişim kuralı bir günlük yordam yalıtım ve neonatal fare cardiomyocytes bir 96-şey hücre kültür plaka kültür açıklar. Buna ek olarak, bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak oksijen tüketimi ölçmek için yordamı açıklar. Tüm çözümler kullanılan steril veya steril filtre. Tüm araçları % 75 etanol tarafından sterilize. Yordamı çeşitli bölümleri için bir Tablo malzeme sağlar. Cardiomyocytes kültür için tüm yordamları ve adımları bir standart hücre kültür mahallede gerçekleştirilir. Bu iletişim kuralı–dan bir çöp (yaklaşık 8-10 yavru) yenidoğan fare kalplerin yalıtım için geliştirilmiştir. Ancak, iletişim kuralı da cardiomyocytes birden çok çöp üzerinden yalıtmak için adapte edilebilir.

Protocol

Yenidoğan fareler ile çalışmaları için lütfen yerel üniversite/Enstitü yönergeleri ileri hayvan bakımı programlar tarafından bakın ve kişinin kurumsal ve diğer uygun düzenlemeler için uygun. Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri UC San Diego kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve federal ve eyalet düzenlemelere uygun. 1. hazırlanması reaktifler 25 mL öncesi sindirim çözeltisihazırlamak: t…

Representative Results

Açıklanan iletişim kuralını kullanarak, kalpleri gün 0 yenidoğan pups izole edildi. 5 x 105 hücreleri/yavru elde ve cardiomyocytes, yoğunlukları 10 x 103, 20 x 103veya 30 x 103 hücreleri/iyi, 96 iyi tabak (Şekil 2A) numaralı seribaşı. Gecede kültür sonra cardiomyocytes bulundu iyi kaplı plastik yüzey için ekli vardı (ekli olmayan hücreleri hala görünür gibi yuvarlak ve parlak, dağılın ola…

Discussion

Bu çalışmada, yalıtma ve fare yenidoğan cardiomyocytes kültür için basit bir protokol kurduk. Bu cardiomyocytes kullanarak, biz de bir hücre dışı akı analiz sistemi kullanılarak oksijen tüketim oranını ölçmek için koşulları optimize. Protokol bir fare yenidoğan cardiomyocytes nasıl çeşitli faktörlere ne olduğu gibi organ ölçülen akin to Heart, asıl çalışma hücrelerdeki oksijen tüketimi değiştirebilirsiniz incelemek için bir model sistemi olarak kullanmak izin verir. Bizim daha önc…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tüm Ross laboratuvar ve Murphy laboratuvar üye teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Y.C. NIH (HL115933, HL127806) ve R.S.R. için VA hak (BX003260) Amerikan Kalp Derneği (14SDG17790005) tarafından desteklenmektedir

Materials

Antimycin A SIGMA A8674 Inhibits complex III of the mitochondria
Cell strainer 100 μm pores FALCON 352360 To capture undigested tissue
Collagenase type II Worthington LS004176 To make collagenase digestion solution
D-Glucose SIGMA 75351 To make mitochodnrial stress test medium
DMEM high glucose Life technologies 11965-092 To make cell culture medium
DMEM without NaHCO3, Glucose, pyruvate, glumanine, and Hepes SIGMA D5030-10X1L To make mitochodnrial stress test medium
FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone) SIGMA C2920 Uncouples mitochondrial respiration
Fetal bovine serum (FBS) Life technologies 26140-079 To make cell culture medium
Fibronectin from bovine plasma SIGMA F1141-5MG To make coating solution for tissue culture plates
Fine scissors Fine Sciences Tools 14060-10 For dissection of hearts
Gelatin from porcine skin SIGMA G-1890 To make coating solution for tissue culture plates
HBSS (Hank's balnced salt solution,without Ca2+, Mg2+) Cellgro 21-022-CV To wash hearts and make pre-digestion and collagnase digestion solution
HEPES (1M) Fisher scientific 15630080 To make mitochodnrial stress test medium
Horse serum Life technologies 26050-088 To make cell culture medium
L-Glutamine SIGMA G-3126 To make mitochodnrial stress test medium
M-199 Cellgro 10-060-CV To make cell culture medium
Moria spoon Fisher scientific NC9190356 To wash hearts 
Oligomycin SIGMA 75351-5MG Inhibits mitochondrial ATP synthase
RIPA buffer Fisher scientific 89900 To lyse the cells for protein assay
Rotenone SIGMA R8875 Inhibits complex I of the mitochondria
Seahorse XFe96 Extracellular Flux
Analyzer
Agilent Device used to analyze oxygen consumption rate
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102601-100 Package of flux analyzer culture plates, sensor cartridges, and calibrant
Sodium pyruvate SIGMA P2256 To make mitochodnrial stress test medium
Straight scissors Fine Sciences Tools 91401-12 For dissection of hearts
Syringe filter 0.2 μm size For sterile filtration of digestion medium
Trypsin USB Corporation 22715 25GM To make pre-digestion solution

Referanslar

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C., Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116 (2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13 (2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture – an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746 (2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Tachibana, S., Chen, C., Zhang, O. R., Schurr, S. V., Hill, C., Li, R., Manso, A. M., Zhang, J., Andreyev, A., Murphy, A. N., Ross, R. S., Cho, Y. Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer. J. Vis. Exp. (144), e59052, doi:10.3791/59052 (2019).

View Video