Özet

Mikroelektrot Impalement yöntemi bir kanüle orta serebral arter membran potansiyelini kaydetmek için

Published: July 02, 2019
doi:

Özet

Bu makalenin birincil amacı, mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemini kullanarak orta serebral arter membran potansiyelinin (Vm) nasıl kaydetilme ayrıntılarını sağlamalıdır. Kanüle orta serebral arter miyojenik tonu elde etmek için dengelenmiş, ve damar duvarı yüksek direnç mikroelektrotları kullanılarak kazığa olduğunu.

Abstract

Membran potansiyeli (Vm) vasküler pürüzsüz kas hücrelerinin damar tonu ve böylece bir organ kan akışını belirler. Hastalık koşullarında Vm düzenleyen iyon kanalları ve elektrojenik pompalar ifade ve fonksiyon değişiklikleri potansiyel vmdeğiştirebilir, vasküler ton, ve kan akışı. Böylece, Elektrofizyoloji temel bir anlayış ve doğru sağlıklı ve hastalıklı Devletler Vm kaydetmek için gerekli yöntemleri esastır. Bu yöntem v m ‘yi geri yüklemek için farklı farmakolojik ajanlar kullanarak modül Vm izin verecektir. Her ne kadar çeşitli yöntemler vardır, her biri avantajları ve dezavantajları ile, bu makalede mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanarak orta serebral arter gibi kanüllü direnç damarlarından Vm kaydetmek için protokoller sağlar. Orta serebral arterlerin bir miyografi odasında miyojenik tonu elde etmek için izin verilir, ve damar duvarı yüksek direnç mikroelektrotlar kullanılarak kazığa. Vm sinyali, Digitized ve analiz edilen bir elektrometre aracılığıyla toplanır. Bu yöntem, hücrelere zarar vermeden ve membran direncini değiştirmeden bir damar duvarının Vm ‘nin doğru bir şekilde okunmasını sağlar.

Introduction

Bir hücrenin membran potansiyeli (Vm), plazma membranında iyonik şarjın göreceli farkını ve membranın bu iyonlara göreli geçirgenliğini ifade eder. Vm , iyonların diferansiyel dağılımı ile üretilir ve iyon kanalları ve pompaları ile korunur. K+, na+ve CL gibi Iyon kanalları, dinlenme Vm‘ye önemli ölçüde katkıda bulunur. Vasküler pürüzsüz Kas hücreleri (VSMCs) dört farklı türde K+ kanal1, iki tip gerilim-Gated CA2 + kanal (Vgcc)2, iki tip CL kanal3, 4 , 5, mağaza tarafından işletilen CA2 + kanallar6, Stretch-aktive Kif kanalları7,8, ve elektrojenik Sodyum-Potasyum ATPaz pompaları9 plazma membranlarında, hepsi olabilir Vmdüzenlenmesi dahil.

VSMCs Vm lümen basıncına bağlıdır. Basınçlı olmayan damarlarda, Vm -50 ila-65 MV arasındadır, ancak basınçlı arter segmentlerinde vm -37-47 MV10arasındadır. İntravasküler basınç yükselmesi VSMCs11depolarize neden olur, vgcc açılış için eşik azalır ve miyokojenik ton gelişimine katkı kalsiyum akımı artar12. Aksine, pasif veya basınçlı olmayan damarlarda, yüksek K+ kanal aktivitesi nedeniyle membran hiperpolarizasyonu, VGCC ‘nin açılmasını önleyecek, sınırlı kalsiyum girişine ve hücre içi kalsiyum azalmasına neden olur, daha az katkı vasküler ton13. Böylece, lümen basıncında yapılan değişikliklerden dolayı Vm , vasküler ton gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır ve hem VGCC hem de K+ kanalları vm‘nin düzenlenmesi konusunda önemli bir rol oynamaktadır.

Vm gemi tipi ve türler arasında değişir. Vm -54 ± 1,3 MV içinde Gine domuzu üstün mezenterik arter şeritleri14,-45 ± 1 mV Rat orta serebral arterlerde içinde 60 mmHg lümen basıncı12, ve-35 ± 1 mV sıçan parankimal arter içinde 40 mmHg lümen basıncı15. Uzanmış sıçan lenfatik kas içinde kaydedilen istirahat Vm -48 ± 2 mV16. Vm serebral VSMCs periferik arterlerde daha negatiftir. Karşılaştırıldığında, kedi orta serebral arterlerin yaklaşık bir Vm olduğu bildirilmiştir-70 MV, mezenterik ve koroner arterlerin olması bildirildi iken-49 ve-58 MV, sırasıyla17,18. Vasküler yataklarda Vm ‘deki farklar iyon kanallarının ve elektrojenik Sodyum-Potasyum pompaların ifade ve fonksiyonlarında farklılıklar gösterebilir.

Vm ‘de artar ve azalır, sırasıyla membran depolarizasyon ve hiperpolarizasyon olarak adlandırılır. Vm ‘deki bu değişiklikler, iyon kanallı gating, hücre sinyalizasyon, kas kasılma ve eylem potansiyel yayılma gibi birçok fizyolojik süreçte merkezi bir rol oynamaktadır. Sabit bir basınçta, K+ kanallarını aktive eden birçok endojen ve sentetik vazodilatör bileşiği membran hiperpolarizasyonuna neden olur ve vazodikasyon1,13ile sonuçlanır. Tersine, sürekli membran depolarizasyon agonist kaynaklı veya reseptör aracılı vazokonstriksiyon19hayati önem taşımaktadır. Vm yalnızca vgcc13 aracılığıyla CA2 + akımı düzenleyen değil, aynı zamanda CA 2+ ‘ nın dahili mağazalardan20,21 ve CA2 +-duyarlılığından etkileneceği kritik bir değişkendir kontril cihaz22.

Farklı hücre türlerinden Vm kaydetmek için çeşitli yöntemler olsa da, kanüle damarların mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi toplanan veriler izole vsmcs elde edilen verilerden daha fizyolojik gibi görünüyor. Mevcut kelepçe yöntemlerini kullanarak yalıtılmış VSMC ‘den kaydedildiğinde, Vm VSMCs24‘ te spontan geçici hiperpolarizasyon olarak görülür. Yalıtılmış VSMCs syncytium değildir ve seri direncinde yapılan değişiklikler Vm‘nin osiloryumu davranışına katkıda bulunabilir. Öte yandan, vm bozulmamış damarlardan kaydedildiğinde osilasyon davranışı görülmez, muhtemelen arter içinde restorasyonudur olan ve istikrarlı bir Vm ‘ye giden gemi boyunca toplanan vsmcs arasında hücre hücresi teması nedeniyle 24. böylece, standart mikroelektrot Kazığa oturtma tekniği kullanılarak basınçlı damarlardan Vm ölçümü, fizyolojik koşullara nispeten yakındır.

Kanule edilen damarlardan vm kayıt hayati bilgi sağlayabilir, restorasyonudur vm vsmcs vasküler ton ve kan akışının önemli belirleyici biridir, ve vm modülasyon dilate ya da bir yol sağlayabilir kan damarlarını sıkı sıkıdır. Böylece, Vmkaydında yer alan metodolojisi anlamak önemlidir. Bu makalede, mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanılarak kanüle orta serebral arterlerden (MCAS) Vm hücre içi kayıt açıklanmaktadır. Bu protokol MCAS hazırlamak için nasıl açıklayacaktır, mikroelektrotlar, elektrometre kurmak ve Vmkaydetmek için Kazığa oturtma yöntemi gerçekleştirmek. Ayrıca, temsili veri, bu yöntem ve olası sorunları kullanırken karşılaşılan ortak sorunlar ele alınmıştır.

Protocol

Erkek fareler, laboratuvar hayvan bakımı (AAALAC) değerlendirme ve akreditasyon için dernek tarafından onaylanmış UMMC, hayvan bakım tesisinde yer aldı. Hayvanların çalışma boyunca yiyecek ve suya ücretsiz erişimi vardı. Hayvanlar kontrollü bir ortamda 24 ± 2 °C sıcaklıkta, 60 – 80% ve 12 saat ışık/karanlık Döngülerde nem seviyeleri ile korundu. Tüm protokoller UMMC hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. ekipmanların hazırlanması</…

Representative Results

Sunulan yöntem, kanüle edilen damarlarda Vm kaydetmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir. MCA ‘yı beyinden nasıl yalıtmayı anlatan kısa bir prosedür Şekil 1a’da sunulmuştur. Beyni kafatasından ayırdıktan sonra, MCA dışarı disseke ve düşük kalsiyum PSS içeren bir petri çanak yerleştirilir. Bağlı olan bağ dokusunun bir kısmı da MCA ile birlikte, izolasyon sırasında MCA ‘ya zarar vermemek için yay makas ve fors…

Discussion

Bu makalede, bir kanüle damar hazırlama Vm kaydetmek için keskin bir mikroelektrot Kazığa oturtma yöntemi kullanmak için gerekli adımları sağlar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılır ve yüksek kaliteli, tutarlı bir dizi deneysel soruya cevap Vm kayıtları sunuyor.

Bazı kritik hususlar ve sorun giderme adımları, yöntemin başarısını sağlamak için burada açıklanmıştır. Mikroelektrot (netlik ve direnç) ve hücresel Proses kalitesi Vm‘…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma UMMC gelen Intramural destek araştırma programı (IRP) tarafından hibe tarafından kısmen desteklenmektedir, AHA Scientist kalkınma Grant (13, 14000006) coşkun R. Pabbidi verilir.

Materials

Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

Referanslar

  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).
  3. Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
  4. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  5. Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).
  6. Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).
  7. Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
  8. Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).
  9. Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).
  10. Coca, A., Garay, R. . Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).
  11. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).
  12. Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).
  13. Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
  14. Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).
  15. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
  16. Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).
  17. Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).
  18. Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).
  19. Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).
  20. Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
  21. Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).
  22. Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).
  23. Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
  24. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

View Video