-Alkolsüz Steatohepatitis (NASH) çözünürlük değerlendirmek farelerde hayatta kalınabilir karaciğer biyopsisi yordam eklenmesi

Alkolsüz steatohepatitis (NASH) Progresif bir karaciğer hastalığı ve obezite ve tip 2 Diyabet ile dernek nedeniyle giderek yaygın hale geliyor bu alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), daha ağır bir tür olduğunu. NAFLD/NASH ya da onaylı biyolojik kolayca hastalık ilerleme değerlendirmek için onaylanmış hiçbir tedaviler vardır. NASH tanısı histolojik olarak inflamasyon değerlendirme tarafından karaciğer lipid (yağlanma), balon Hepatosit ve fibrozis^1,2,3,4fazla. Klinik çalışmalarda, bu bitiş noktası biyopsi ile ve ikinci karaciğer biyopsisi belirli bir tedavi süre sonra toplanan bir karaciğer örnek çalışmada önce değerlendirilir. Böylece, test aracısı etkinliğini karaciğer patolojisi olan bireylerde değişiklik ile daha önce tespit/sayısal değerlendirilir (yani, biyopsi kanıtlanmış) tedavi gruplarına randomize NASH. Bu aynı histolojik bitiş noktaları genellikle potansiyel NASH therapeutics preklinik çalışmaları, ancak yalnızca terminal doku euthanized fareler ve böylece temel ve bir yetersizlik etkinlik derecesini bir anlayış olmadan değerlendirirken kemirgen modellerinde kullanılır temel hastalık durumu tedavi grupları arasındaki farkları için kontrol etmek için.

Yetişkin NAFLD ile % 25'i NASH için yükseltilmiş serum aminotransferaz düzeyleri temel alınarak tahmin ediliyor olsa da, NASH histolojik kanıt⁴dışında onaylamak için alternatif yok kesin yöntem vardır. Radyolojik yöntemleri (ultrason, bilgisayarlı tomografi ve manyetik rezonans görüntüleme) gibi noninvaziv yöntemler hepatik yağlanma algılamak için geliştirilmiştir, ancak bu yöntemleri NASH tanılayamaz veya fibrozis sahne belirlemek. Geçici elastography karaciğer Sertlik ölçme için umut verici bir non-invaziv modality sunmaktadır. Fibrozis aşamaları ayırt doğru olarak gösterilmiştir. Ancak, daha yüksek vücut kitle indeksi (VKİ) ve yağ dokusu ile doğruluğu azalır. ⁵ bu obez olarak NASH hastaların çoğu nedeniyle problemlidir. Bu yaklaşımlar klinik önemi, Bu modalities hiçbiri preklinik çalışmalarda kullanılmaktadır.

Bu sorunu gidermek için Dr Jonathan Roth araştırma grubu bir karaciğer biyopsisi yordam NASH^6,7,8Amylin NASH (AMLN) fare modeli uygulamak için ilk idi. Onlar akıllı metabolik hastalık ile korelasyon NASH hastalığının derecesi ile biyopsi geçerliliği nitelendirdi. Karaciğer biyopsisi yordam NASH, AMLN modeli ve yararını tedavi edici bir ortamda, özellikle liraglutide etkinliğini değerlendirmek için burada biz ayrıntılı olarak tarif.

Bütün içinde vivo deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) MedImmune, LLC ve kılavuz ile anlaşma politikalarına uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanlarının, 8 edition (2011) için yapılmıştır. Erkek C57BL6J fareler yüksek yağlı, yüksek fruktoz, yüksek kolesterol AMLN diyet yerleştirildi. 26 hafta diyet, farmakolojik müdahalesi başlamadan önce 3 hafta sonra karaciğer biyopsi yapıldı.

1. alın ve cerrahi malzemeleri hazırlamak

1. Otoklav steril aletlerin (küçük sivri uçlu makas, künt ipucu forseps, pamuk temizleme bezi, gazlı bez kareler, 7 zımba/yara mm klipleri ve zımba).
2. Elde etmek, karın duvarı (PC-1 iğne ile 5-0 kaplamalı absorbe dikiş uygundur), (Kan durdurucu sargı amaçlar için kullanılmak üzere) sıkıştırılmış absorbe jelatin sünger, steril Örtüler ve eldiven, iyot tabanlı fırçalayın ve % 70 etanol temizleme bezi/mendil kapatmak için steril dikiş , buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg doz başına fare; fare başına en az 3 doz) ve cerrahi göz merhem/yağlama.
3. Buharlaştırıcı isoflurane ile doldurarak anestezi için hazırlayın.
4. Hayvanlar arasında hızlı araç sterilizasyon için bir boncuk Sterilizatör açın.
5. Bir ısınma yüzey veya Isıtma yastığını, hayvan kurtarma için kullanılmak üzere açın.
6. Don uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) (yani, maske, elbise, saç kaporta, eldiven).

2. cerrahi öncesi hazırlıklar

1. 2-%3 isoflurane akışı etkisi ile indüksiyon odasına fareyi getirin.
2. Anestezi derinliği uygun yanıt-e doğru ayak parmağı-çimdik eksikliği doğrular kadar fareyi gözlemlemek.
3. Bir göz merhem kuruluk kornea anestezi ile ilişkili önlemek için kullanın.
4. Buprenorfin subkutan yönetmek (0,05-0,1 mg/kg).
5. Cerrahi sitesi hayvan kesme makineleri kullanarak xiphoid sürecinin hemen Kaudal tıraş.
6. Fareyi ısıtmalı bir yüzey (37 ° C) cerrahi sitesi tıraş sonra. Fare, dorsal yüzeyi aşağı doğru olduğunu ve karın maruz şekilde yerleştirirsiniz. Fare burun isoflurane % 2-3 akış hızında teslimini kolaylaştırmak için anestezi burun konisi yerleştirin.
7. Cerrahi sitesi betadin ve % 70 etanol alternatif temizleme bezi ile (3 kere) temiz.
8. Açık ve kadar steril cerrahi aletler.
9. Eldiven kaldırın ve steril cerrahi eldivenler ile değiştirin.

3. cerrahi müdahale

1. Makas (1-2 cm), hemen Kaudal xiphoid sürecinin ve fare sol tarafında, karın cilt için biraz ile boyuna bir kesi yapmak.
2. Künt karın duvarı forseps ve makas kullanarak uzak cilt incelemek.
3. Karın duvarının açığa ve karaciğer altında görselleştirmek.
4. Steril neşter bıçak yapmak bir kesi (1-2 cm) karaciğer sol-lateral LOB (LLL) görselleştirmek için karın duvarı kullanarak.
   Not: Çalışma tutarlı olması. Diğer ortak loblar ilgi sağ medial LOB (RML) ve sol medial LOB (hayatımı seviyorum) vardır.
5. Belgili tanımlık kesme yoluyla sol yan lob yansıtmak.
6. Seçenek 1: Başparmak ve işaret parmağı LLL bir kısmını ortaya çıkarmak için karın hafifçe masaj.
7. Seçenek 2: yer altında bir bölümü yavaşça çekmeye LLL steril pamuklu çubukla maruz.
8. Steril ve sulu bir yüzey üzerinde yalan karaciğer için izin vermek için LLL altına gazlı bez bir steril serum fizyolojik bulanmış parça yerleştirin.
9. Kama şeklinde bir parça karaciğer LLL steril makasla iki kesim yaparak kes.
   Not: 30-50 mg kaldırılmakta olan karaciğer yaklaşık boyutudur (< %5 farelerde karaciğer).
10. Jelatin sünger bir parça benzer boyutunda karaciğer kama parçası kesti. Sünger forseps kullanarak karaciğer kesilmiş bölümünü içine yerleştirin.
11. Forseps ile sünger tutmak ve karaciğer ile temas kadar karaciğer yüzeye yapışır ve hemostaz elde korumak.
12. Yer karaciğer biyopsisi parça uygun tüp içine (yani donmuş, sabitleştirici, vs.).
13. Yavaşça karaciğer sünger bozmamaya dikkat çekici geri karın boşluğuna, yerleştirin.
14. Karın duvarı ile tam bir kare düğüm ile başlayıp 5-0 kaplamalı absorbe Dikiş dikiş.
15. Cilt 7 mm yara klip (veya zımba) ile kapatın.
16. Belgili tanımlık kesme tam bir kapatma emin olmak için yara klipleri bakarak kontrol edin.
17. Fare burun konisi çıkarın ve ısıtmalı bir yüzey üzerinde temiz bir kafes içine yerleştirin.
18. 10-20 s. için yer aygıtlar fareler arasında boncuk ısıtıcı içine tüm organik malzeme cam boncuk Sterilizatör yerleştirerek önce steril serum fizyolojik kullanarak aygıtlar üzerinden kaldırılması gerektiğini emin olun.

4. ameliyat sonrası bakım

1. Kadar bilincinin tekrar yerine geleceğinden ve kendisi sağ fare izleyin.
2. Ameliyat sonrası gözlemleri kaydetmek ve fareler yırtılması için her gün kontrol edin.
3. Buprenorfin ikinci ve üçüncü doz yönetmek (0,05-0,1 mg/kg) subkutan 6-8 h sonrası cerrahi ve tekrar ameliyat sonrası 24 saat.
4. 7-10 gün ameliyat sonrası yara klibe kaldırın.

Bu çalışmada, fareler tedavi gruplarına randomize (n = 12/grup) öncesi çalışma biyopsi fibrozis sınıf ve vücut ağırlığını dayalı. Fareler yönetilen araç (PBS) veya liraglutide (5 nmol/kg) 42 gün (araç ya da bileşik yönetilen 10 mL/birim, subkutan, doz günde bir kez kg) için. 42 günde fareler sigara oruç devlet ve güvenliğe ve histoloji için işlenen karaciğer (CO2 inhalasyon yolu ile) euthanized.

Biyopsi ve terminal karaciğer adet gecede % 10 formalin içinde tespit edildi sonra alkol katıştırılmış ve Hematoksilen Eozin ve Sirius kırmızı, via standart protokolleri9boyama için işlenmiş. Doku bölümleri kör bir biçimde NASH etkinlik puanlama (NAS) sistem1,2göre bir patolog tarafından değerlendirildi. NAS'ın hastalığı yağlanma, lobular inflamasyon ve (0-3 puan verilen her parametre) balon Hepatosit derecesi yukarıda açıklanan9olarak yansıtır.

Bu çalışmanın temel (ön biyopsi) fibrozis skoru izin tasarım içine karaciğer biyopsisi ekleme. Toplam 118 farelerin biyopsi NASH diyet 26 hafta sonra ve karaciğer fibrozis ve yağlanma her biyopsi (şekil 1) skorlanmıştır. 118 bu fareler 49 fareler üzerinde düşük fibrozis dayalı bırakıldı (0 puan), yüksek fibrozis (anormal patoloji sergilenen 4 puan) ve anormal kilo kaybı ya da yara iyileşmesi. Bu dışlama kriterleri 69 fareler için izin çalışma grupları atamanız ve tedavi sonrası (şekil 1) NASH fenotip gelişmeler bakın yaptı.

Fareler için 6 hafta araç veya GLP-1R agonist liraglutide (5 nmol/kg) ile tedavi edildi. Araç tedavi grubunda 1 fare sergilenen kötüleşti fibrozis ve 4 fareler kötüleşti NAS skoru gösterdi (Şekil 2A-B). Liraglutide tedavi, tedavi grubu artırma % 17 ve % 83'ü değişmeden kalan fibrozis (şekil 2C) genel bir iyileşme ile ilişkili idi. Benzer şekilde, genel NAS liraglutide tedavi geliştirilmiş (şekil 2B) skor, NAS'ın puan ve % 33 geliştirilmiş grubun ile f değişmemiştir.

Ayrıca, liraglutide tedavi iltihap arttırılmış, grubun % 75'i ile bir alt iltihap puanı ve % 25 olması (şekil 3B) değişmeden kaldı. Araç tedavi iltihabı, yüksek bir iltihap Puan sahip grubun ve % 83 (şekil 3A) değişmemiştir kötüleşti. Yağlanma puanlama sonuna satır taban çizgisinden değişmeden kaldı çalışma gruplarındaki her iki araç ve liraglutide tedavi (şekil 3A, B). Öncesi sonrası biyopsi karşılaştırma vs için bireysel fareler inflamasyon ve Balonculuk parametreleri üzerinde de (şekil 3 c-F) gösterilir.

Şekil 1: karaciğer biyopsisi fibrozis ve NAS'ın Puan ön eleme . (A)gösterimi için karaciğer biyopsisi ile fibrozis gösterildi tüm 118 fareler. Sonra uygun fareler çalışma gruplar halinde sıralanır (B ve C) temel fibrozis ve NAS'ın puan, sırasıyla, gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: fibrozis ve NAS'ın puan, ön biyopsi ve sonrası müdahale. Yüzde Yanıtlayıcı Çözümleme Araç (A, C) veya (B, D) fareler liraglutide tedavi sonuna kadar temel karaciğer biyopsisi üzerinden ölçülen karaciğer çalışma örneği fibrozis sahne (A, B) için ve NAS (C, D). Her grup için sonrası çalışma biyopsisi öncesi çalışma gelen değişim bir çizgiyle gösterilir. Puan puanlama her adımda biraz görsel hayvanlar ayrılması izin vermek için kaymıştır, bu sadece görselleştirme amaçlıdır ve herhangi bir puan farkı yansıtmak zorunda değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: yağlanma, inflamasyon ve balon, ön biyopsi ve sonrası müdahale. Yüzde Yanıtlayıcı Çözümleme Araç (A, C, E) veya (B, D, F) fareler liraglutide tedavi sonuna kadar temel karaciğer biyopsisi üzerinden ölçülen karaciğer çalışma örneği yağlanma için (A, B), Puan edinildi iltihabı (C, D) ve balon (E, F). Her grup için sonrası çalışma biyopsisi öncesi çalışma gelen değişim bir çizgiyle gösterilir. Puan puanlama her adımda biraz görsel hayvanlar ayrılması izin vermek için kaymıştır, bu sadece görselleştirme amaçlıdır ve herhangi bir puan farkı yansıtmak zorunda değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

S.O. ve C.R. geçerli çalışanların ve/veya MedImmune/AstraZeneca hissedarları vardır. JLT bu deneyler yapılmıştır zamanda bir çalışan ve MedImmune/AstraZeneca hissedar oldu.