Bu protokolde, dendritik filopodial arasında belirli ve güçlü bir yakınlık yararlanarak kültürlü hipokampal nöronlar üzerinde fagositik fincan benzeri protrüzyon yapısı dendritik filopodia zengin fraksiyonu arındırmak için bir yöntem tanıtmak yapışma molekül, TLCN, ve bir ekstrasellüler matris molekül, vitronektin.
Dendritik filopodia akinin filament dayalı ince ve uzun çıkıntılar, ve onlar uzatmak ve bir hedef Axon ararken gibi geri çekin. Dendritik filopodia bir hedef Akon ile temas kurduğunda, bir sinaps oluşumuna yol açan, spines içine olgunlaşmak başlar. Telencephalin (TLCN) oldukça dendritik filopodia lokalize ve yavaş yavaşça spines hariç tutulur. Kültürlü hipokampal nöronlar içinde TLCN aşırı ifade dendritik filopodia oluşumu indükler. Biz telencephalin güçlü bir hücre içi matris molekül, vitronektin bağlar gösterdi. Vitronectin kaplı mikrobilyeleri nöronal dendrites üzerinde fagositik fincan oluşumu kaynaklı. Phagositik kupada, TLCN, fosforilated ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) ve F-actin gibi TLCN-bağlayıcı proteinler birikir, bu da fagositik kupanın bileşenlerinin dendritik filopodia ‘ya benzer olduğunu göstermektedir. Böylece, dendritik filopodia yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Manyetik polistiren boncuklar, hipokampal nöronların kültür ortamında bulunan ve nöronal dendrites üzerinde fagositik bardak oluşumunu tetikleyen vitronektin ile kaplanmıştır. 24 saat inkübasyon yapıldıktan sonra, fagositik bardak deterjan ile hafif bir şekilde çözünmeli ve mıknatıs ayırıcı kullanılarak toplanır. Boncukları yıkadıktan sonra, bağlayıcı proteinler gümüş boyama ve Batı bloplama ile incelenmiş ve analiz edilmiştir. Bağlayıcı fraksiyonda, tlcn ve aktin bol miktarda mevcut. Buna ek olarak, kesir tespit birçok protein dendritik filopodia lokalize edildi; Bu nedenle, biz dendritik filopodia-zengin fraksiyonu olarak bağlayıcı fraksiyonu adı. Bu makalede, dendritik filopodia zengin kesir için arıtma yöntemi ile ilgili ayrıntıları açıklar.
Dendritik filopodia, spines öncüleri olduğu düşünülmektedir. Dendritik filopodia içinde actin filamin uzatma ve retraksiyon1,2,3düzenler. Bir Axon ile temas ettikten sonra, seçilmiş dendritik filopodia, olgunlaşmasını spines içine başlar ve bir sinaps4,5oluşur. Dikenler bileşenleri postsinaptik yoğunluk kesirler6,7kapsamlı analizinden belirlendi, dendritik filopodia bileşenleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır süre. Bu, telencephalin (tlcn), erm, syngap, RAS, pıkinaz, AKT, mTOR, Polo benzeri kinaz 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 ve ephb, dendritik filopodia oluşumu5,8,9 düzenleyen gösterildi ,10,11, bir yöntem ise dendritik filopodia mevcut moleküllerin kapsamlı analizi için geliştirilmiştir değil.
Tlcn (ICAM-5) özellikle en rostral beyin segmentinde dikenli nöronlar tarafından ifade edilir, telencephalon12. TLCN, hücre dışı bölgesinde 9 IG benzeri etki alanı, bir transmembran bölgesi ve sitoplazmik kuyruk13‘ ü vardır. Tlcn, hücre dışı bölgesinde vitronektin (VN) ve LFA-1 integrine, transmembran bölgesinde presenilin ‘e, sitoplazmik bölgesinde fosho-ERM ve α-actinin ‘e bağlar5,8,14,15 ,16. Tlcn, dikenler ve dendritik şaftlar içinde dendritik filopodia ve α-actinin iplerinde phospho-ERM yoluyla akin sitoiskelet bağlar8,16.
Biz tlcn gelişmiş dendritik filopodia oluşumu ekspresyonu gösterdi ve filopodia10için dikenler reversion indüklenmiş. Teknikerleriniz ‘in kurucu aktif formu tlcn sitoplazmik bölgeye bağlı ve gelişmiş dendritik filopodia oluşumu8. Böylece TLCN, akin bağlayıcı proteinlerle dendritik filopodia oluşumunu düzenler. Esselens ve ark. mikroboncuklar kültürsüz nöronlar üzerinde TLCN birikimi kaynaklı gösterdi17. Fagositik fincan yapısının, VN kaplı mikroboncuk etrafında nöronal dendritler üzerinde, TLCN-bağımlı bir biçimde15‘ te oluştuğunu gösterdik. Dendritik filopodia bileşenleri fagositik kupalar benzer. Dendritik filopodia toplamak zordur, ama manyetik mikroboncuk kullanarak fagositik fincan toplamak nispeten daha kolaydır. Böylece, dendritik filopodia18yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Burada, dendritik filopodia zengin fraksiyonu için arıtma yöntemi açıklanmaktadır.
Biz, hücre yapışma molekül TLCN ve ekstrasellüler matris protein vitronektin arasında benzeşimi kullanarak dendritik filopodia zengin fraksiyonu için bir arıtma yöntemi geliştirdi. PSD kesir ile karşılaştırıldığında, dendritik filopodia zengin fraksiyondan olgunlaşmamış sinaps üzerinde hareket sinaptik proteinlerin tanımlamak mümkün olabilir. Böylece, dendritik filopodia zengin fraksiyonu bileşenleri% 74 tarafından PSD kesir olandan farklıdır. PSD kesir farklı, biz aktif fagositik bardak o…
The authors have nothing to disclose.
Biz hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürü için Shigeo Okabe ve Hitomi Matsuno teşekkür, tlcn eksikliği fareler için Masayoshi Mishina, teknik yardım için Sachiko Mitsui ve Momoko Shiozaki ve yararlı tartışmalar için Yoshihara Laboratuvarı üyeleri . Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant NOS tarafından desteklenmektedir. JP20700307, JP22700354 ve JP24500392 ve MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 için YF ve JP20022046, JP18H04683 ve JP18H05146 YY.
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
1.7 ml Low Binding MCT | Sorenson BioScience | 39640T | |
200 mM L-Glutamine | Gibco | 2530149 | |
35-mm plastic cell culture dishes | Corning | 430165 | |
Anti-actin | Sigma-Aldrich | A-5060 | |
Anti-alpha-Actinin | Sigma-Aldrich | A-5044 | |
Anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T-9026 | |
Anti-Ezrin | Sigma-Aldrich | clone3C12, SAB4200806 | |
Anti-Galphaq | Santacruz | sc-393 | |
Anti-MAP2 | Chemicon | clone AP20, MAB3418 | |
Anti-Moesin | Sigma-Aldrich | clone 38/87, M7060 | |
Anti-PLCbeta1 | Santacuz | sc-5291 | |
Anti-PSD95 | MA2 | ABR | |
Anti-Spectrin beta | Chemicon | MAB1622 | |
B27 | Gibco | 0080085SA | |
BCA protein assay kit | Thermo | 23227 | |
Bromophenol blue | Merck | 1.08122.0005 | |
calcium chrolide, hydrous | Wako | 038-19735 | |
Cell scraper | Falcon | 353085 | |
Cell strainer | Falcon | 352350 | |
Choline chloride | Sigma-Aldrich | C7527 | |
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | |
Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C-6645 | |
DNase-I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P5155 | |
DynaMag-2 Magnet | Thermo | 12321D | |
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE | RPN2232 | |
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel | ATTO | E-T520L | |
Folic acid | Sigma-Aldrich | F8758 | |
HBSS | Gibco | 14175095 | |
HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
i-Inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | |
LAS-1000 mini | Fuji Film | LAS-1000 mini | For detection of luminescence from WB membrane |
Magnetic polystyrene microbeads | Sperotech | PM-20-10 | |
MEM amino acid solution | Gibco | 11130-051 | 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine |
Mini-slab size electrophoresis system | ATTO | AE-6530 | |
Niacinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Penicilin / Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 4906845001 | |
Poly-L-lysine hydrobromide | Nacali | 28360-14 | |
Pyridoxal HCl | Sigma-Aldrich | P6155 | |
Riboflavin | Sigma-Aldrich | R9504 | |
Silver Stain 2 Kit wako | Wako | 291-5031 | |
Thiamine HCl | Sigma-Aldrich | T1270 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 1703940JA | |
Ultra pure water | MilliQ | For production of ultra pure water |