Özet

Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Published: May 02, 2019
doi:

Özet

Bu protokolde, dendritik filopodial arasında belirli ve güçlü bir yakınlık yararlanarak kültürlü hipokampal nöronlar üzerinde fagositik fincan benzeri protrüzyon yapısı dendritik filopodia zengin fraksiyonu arındırmak için bir yöntem tanıtmak yapışma molekül, TLCN, ve bir ekstrasellüler matris molekül, vitronektin.

Abstract

Dendritik filopodia akinin filament dayalı ince ve uzun çıkıntılar, ve onlar uzatmak ve bir hedef Axon ararken gibi geri çekin. Dendritik filopodia bir hedef Akon ile temas kurduğunda, bir sinaps oluşumuna yol açan, spines içine olgunlaşmak başlar. Telencephalin (TLCN) oldukça dendritik filopodia lokalize ve yavaş yavaşça spines hariç tutulur. Kültürlü hipokampal nöronlar içinde TLCN aşırı ifade dendritik filopodia oluşumu indükler. Biz telencephalin güçlü bir hücre içi matris molekül, vitronektin bağlar gösterdi. Vitronectin kaplı mikrobilyeleri nöronal dendrites üzerinde fagositik fincan oluşumu kaynaklı. Phagositik kupada, TLCN, fosforilated ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) ve F-actin gibi TLCN-bağlayıcı proteinler birikir, bu da fagositik kupanın bileşenlerinin dendritik filopodia ‘ya benzer olduğunu göstermektedir. Böylece, dendritik filopodia yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Manyetik polistiren boncuklar, hipokampal nöronların kültür ortamında bulunan ve nöronal dendrites üzerinde fagositik bardak oluşumunu tetikleyen vitronektin ile kaplanmıştır. 24 saat inkübasyon yapıldıktan sonra, fagositik bardak deterjan ile hafif bir şekilde çözünmeli ve mıknatıs ayırıcı kullanılarak toplanır. Boncukları yıkadıktan sonra, bağlayıcı proteinler gümüş boyama ve Batı bloplama ile incelenmiş ve analiz edilmiştir. Bağlayıcı fraksiyonda, tlcn ve aktin bol miktarda mevcut. Buna ek olarak, kesir tespit birçok protein dendritik filopodia lokalize edildi; Bu nedenle, biz dendritik filopodia-zengin fraksiyonu olarak bağlayıcı fraksiyonu adı. Bu makalede, dendritik filopodia zengin kesir için arıtma yöntemi ile ilgili ayrıntıları açıklar.

Introduction

Dendritik filopodia, spines öncüleri olduğu düşünülmektedir. Dendritik filopodia içinde actin filamin uzatma ve retraksiyon1,2,3düzenler. Bir Axon ile temas ettikten sonra, seçilmiş dendritik filopodia, olgunlaşmasını spines içine başlar ve bir sinaps4,5oluşur. Dikenler bileşenleri postsinaptik yoğunluk kesirler6,7kapsamlı analizinden belirlendi, dendritik filopodia bileşenleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır süre. Bu, telencephalin (tlcn), erm, syngap, RAS, pıkinaz, AKT, mTOR, Polo benzeri kinaz 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 ve ephb, dendritik filopodia oluşumu5,8,9 düzenleyen gösterildi ,10,11, bir yöntem ise dendritik filopodia mevcut moleküllerin kapsamlı analizi için geliştirilmiştir değil.

Tlcn (ICAM-5) özellikle en rostral beyin segmentinde dikenli nöronlar tarafından ifade edilir, telencephalon12. TLCN, hücre dışı bölgesinde 9 IG benzeri etki alanı, bir transmembran bölgesi ve sitoplazmik kuyruk13‘ ü vardır. Tlcn, hücre dışı bölgesinde vitronektin (VN) ve LFA-1 integrine, transmembran bölgesinde presenilin ‘e, sitoplazmik bölgesinde fosho-ERM ve α-actinin ‘e bağlar5,8,14,15 ,16. Tlcn, dikenler ve dendritik şaftlar içinde dendritik filopodia ve α-actinin iplerinde phospho-ERM yoluyla akin sitoiskelet bağlar8,16.

Biz tlcn gelişmiş dendritik filopodia oluşumu ekspresyonu gösterdi ve filopodia10için dikenler reversion indüklenmiş. Teknikerleriniz ‘in kurucu aktif formu tlcn sitoplazmik bölgeye bağlı ve gelişmiş dendritik filopodia oluşumu8. Böylece TLCN, akin bağlayıcı proteinlerle dendritik filopodia oluşumunu düzenler. Esselens ve ark. mikroboncuklar kültürsüz nöronlar üzerinde TLCN birikimi kaynaklı gösterdi17. Fagositik fincan yapısının, VN kaplı mikroboncuk etrafında nöronal dendritler üzerinde, TLCN-bağımlı bir biçimde15‘ te oluştuğunu gösterdik. Dendritik filopodia bileşenleri fagositik kupalar benzer. Dendritik filopodia toplamak zordur, ama manyetik mikroboncuk kullanarak fagositik fincan toplamak nispeten daha kolaydır. Böylece, dendritik filopodia18yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Burada, dendritik filopodia zengin fraksiyonu için arıtma yöntemi açıklanmaktadır.

Protocol

Burada açıklanan tüm yöntemler RıKEN Wako kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. hipokampal nöronların kültürü Kültür ortamının hazırlanması 200x Vitamin karışımı hazırlanması. Çözülür 100 mg D-pantothenic asit hemicalcium tuz, 100 Kolin klorür mg, 100 mg folik asit, 180 mg i-inositol, 100 mg Niacinamide, 100 mg piridoksal HCL, ve 100 mg Thiamin HCL içinde 500 ml Ultra saf su manyetik kar?…

Representative Results

Kültürlü hipokampal nöronlar, TLCN oldukça dendritik filopodia, şaft lokalize ve Soma ve F-actin ile kolokalize (Şekil 1a, B). Kültürlü hipokampal nöronlara polistiren mikroboncuk eklendiğinde, boncuklar otomatik olarak kültür ortamında fetal sığır serumu (FBS) elde edilen vitronektin (VN) ile kaplanmıştır; temelde dendrites bağlı ve onlar fagositik bardak oluşumu indüklenen (Şekil 1B<st…

Discussion

Biz, hücre yapışma molekül TLCN ve ekstrasellüler matris protein vitronektin arasında benzeşimi kullanarak dendritik filopodia zengin fraksiyonu için bir arıtma yöntemi geliştirdi. PSD kesir ile karşılaştırıldığında, dendritik filopodia zengin fraksiyondan olgunlaşmamış sinaps üzerinde hareket sinaptik proteinlerin tanımlamak mümkün olabilir. Böylece, dendritik filopodia zengin fraksiyonu bileşenleri% 74 tarafından PSD kesir olandan farklıdır. PSD kesir farklı, biz aktif fagositik bardak o…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürü için Shigeo Okabe ve Hitomi Matsuno teşekkür, tlcn eksikliği fareler için Masayoshi Mishina, teknik yardım için Sachiko Mitsui ve Momoko Shiozaki ve yararlı tartışmalar için Yoshihara Laboratuvarı üyeleri . Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant NOS tarafından desteklenmektedir. JP20700307, JP22700354 ve JP24500392 ve MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 için YF ve JP20022046, JP18H04683 ve JP18H05146 YY.

Materials

1 M HEPES Gibco 15630-080
1.7 ml Low Binding MCT Sorenson BioScience 39640T
200 mM L-Glutamine Gibco 2530149
35-mm plastic cell culture dishes Corning 430165
Anti-actin Sigma-Aldrich A-5060
Anti-alpha-Actinin Sigma-Aldrich A-5044
Anti-alpha-tubulin Sigma-Aldrich T-9026
Anti-Ezrin Sigma-Aldrich clone3C12, SAB4200806
Anti-Galphaq Santacruz sc-393
Anti-MAP2 Chemicon clone AP20, MAB3418
Anti-Moesin Sigma-Aldrich clone 38/87, M7060
Anti-PLCbeta1 Santacuz sc-5291
Anti-PSD95 MA2 ABR
Anti-Spectrin beta Chemicon MAB1622
B27 Gibco 0080085SA
BCA protein assay kit Thermo 23227
Bromophenol blue Merck 1.08122.0005
calcium chrolide, hydrous Wako 038-19735
Cell scraper Falcon 353085
Cell strainer Falcon 352350
Choline chloride Sigma-Aldrich C7527
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C-6645
DNase-I Sigma-Aldrich DN-25
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma-Aldrich P5155
DynaMag-2 Magnet Thermo 12321D
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent GE RPN2232
e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE gradient gel ATTO E-T520L
Folic acid Sigma-Aldrich F8758
HBSS Gibco 14175095
HRP-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 111-035-144
i-Inositol Sigma-Aldrich I7508
LAS-1000 mini Fuji Film LAS-1000 mini For detection of luminescence from WB membrane
Magnetic polystyrene microbeads Sperotech PM-20-10
MEM amino acid solution Gibco 11130-051 30 mM L-Arginine hydrochloride, 5 mM L-Cystine, 10 mM L-Histidine hydrochloride-H2O, 20 mM L-Isoleucine, 20 mM L-Leucine, 19.8 mM L-Lysine hydrochloride, 5.1 mM L-Methionine, 10 mM L-Phenylalanine, 20 mM L-Threonine, 2.5 mM L-Tryptophan, 10 mM L-Tyrosine, and 20 mM L-Valine
Mini-slab size electrophoresis system ATTO AE-6530
Niacinamide Sigma-Aldrich N0636
Penicilin / Streptomycin Gibco 15070063
PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail Roche 4906845001
Poly-L-lysine hydrobromide Nacali 28360-14
Pyridoxal HCl Sigma-Aldrich P6155
Riboflavin Sigma-Aldrich R9504
Silver Stain 2 Kit wako Wako 291-5031
Thiamine HCl Sigma-Aldrich T1270
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell Bio-rad 1703940JA
Ultra pure water MilliQ For production of ultra pure water

Referanslar

  1. Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).
  2. Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia. Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).
  3. Ziv, N. E., Smith, S. J. Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation. Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).
  4. Lohmann, C., Bonhoeffer, T. A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia. Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).
  5. Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).
  6. Bayes, A., et al. Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins. PLoS One. 7 (10), e46683 (2012).
  7. Bayes, A., et al. Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density. Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).
  8. Furutani, Y., et al. Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).
  9. Mao, Y. T., et al. Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase. Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).
  10. Matsuno, H., et al. Telencephalin slows spine maturation. Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).
  11. Raemaekers, T., et al. ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation. The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).
  12. Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).
  13. Yoshihara, Y., Mori, K. Telencephalin: a neuronal area code molecule?. Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).
  14. Annaert, W. G., et al. Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins. Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).
  15. Furutani, Y., et al. Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin. Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).
  16. Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth. Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).
  17. Esselens, C., et al. Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway. Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).
  18. Furutani, Y., Yoshihara, Y. Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27 (2018).
  19. Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).
  20. Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit. The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).
  21. Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture. European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Furutani, Y., Yoshihara, Y. Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction. J. Vis. Exp. (147), e59292, doi:10.3791/59292 (2019).

View Video