Nanopore sıralamasını uzak konumlarda ve kaynak kötü ayarlarında maliyet-etkili sıralamaya izin veren bir yeni teknoloji. Burada, mRNAs ‘ın bu şartlar ile uyumlu olan tüm kandan sıralanması için bir protokol sunuyoruz.
Uzak konumlarda ve kaynak yetersiz ayarlarında sıralama benzersiz zorluklar sunar. Nanopore sıralama başarıyla bu koşullarda kullanılabilir, ve Batı Afrika ‘ya son Ebola virüs salgını sırasında dağıtılan, bu olasılığı vurgulayarak. Pratik avantajları (düşük maliyetli, ekipman taşıma ve kullanım kolaylığı) ek olarak, bu teknoloji aynı zamanda ikinci nesil sıralama yaklaşımlar, özellikle çok uzun okuma uzunluğu, doğrudan dizi yeteneği üzerinde temel avantajları sağlar RNA ve gerçek zamanlı veri kullanılabilirliği. Ham okuma doğruluğu, bu teknolojinin ana sınırlamasının temsil ettiği diğer sıralama platformlarından daha düşüktür; Ancak, bu kısmen oluşturulan yüksek okuma derinliği tarafından hafifletilebilir. Burada, ebolaviruses için hücresel reseptör olan Niemann-Pick C1 için mRNAs kodlamasının sıralanması için alan uyumlu bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, hayvan kanı örneklerinden RNA ‘nın çıkarılması, hedef zenginleştirme, barkodlama, Kütüphane hazırlama ve sıralamanın kendisi için RT-PCR tarafından izlenen ve diğer DNA veya RNA hedefleri ile kullanılmak üzere kolayca adapte edilebilir.
Sıralama, biyolojik ve Biyomedikal araştırmalarda güçlü ve önemli bir araçtır. Genomlar, genetik varyasyonlar ve RNA ifade profillerinin analizine izin verir ve böylece insan ve hayvan hastalıklarının1,2‘ deki araştırmasında önemli bir rol oynamaktadır. DNA sıralaması için kullanılabilen en eski yöntemlerden biri olan Sanger sıralaması, hala rutin olarak bu güne kadar kullanılır ve moleküler biyolojinin köşe taşı olmuştur. Son 50 yıl içinde, bu teknoloji, 1.000 NT ‘den fazla okuma-uzunlukları ve% 99,9991kadar yüksek bir doğruluk elde etmek için geliştirilmiştir. Ancak, Sanger sıralama da sınırlamalar vardır. Daha büyük bir numune kümesi veya bu yöntemle tüm genomlar Analizi sıralama zaman alıcı ve pahalı1,3. 454 pyrosequencing ve ıllına teknolojisi gibi ikinci nesil (yeni nesil) DNA sıralama yöntemleri, son on yıl içinde sıralamanın gerektirdiği maliyet ve iş yükünü önemli ölçüde azaltmamıza ve büyük bir artış sağladı biyolojik sıralı bilgi miktarı kullanılabilir4. Yine de, bu ikinci nesil teknolojileri kullanarak bireysel sıralı çalışır pahalıdır, ve alan koşullarında sıralama zordur, gerekli ekipman hantal ve kırılgan olduğu gibi (Sanger sıralama cihazları benzer), ve genellikle Özel eğitimli personel tarafından kalibre edilmiş ve servis edilir. Ayrıca, ikinci nesil teknolojilerin çoğu için okuma-uzunlukları oldukça sınırlıdır, genellikle bu verilerin aşağı akım Biyoinformatik Analizi zorlu yapar.
Cep boyutunda nanopore sıralama cihazları kullanarak üçüncü nesil sıralama (bkz. malzeme tablosu) bu kurulan sıralama platformlarına alternatif olarak hizmet verebilir. Bu cihazlarda tek telli bir DNA veya RNA molekül bir nanopore ile aynı anda bir sensör ile ölçülen iyonik akım ile geçer (Şekil 1). Strand nanopore geçer gibi, herhangi bir zamanda gözenek mevcut nükleotidler tarafından akım modülasyon tespit edilir, ve hesaplamalı geri nükleotid sırası5tercüme. Bu operasyonel prensip nedeniyle, nanopore sıralamaları çok uzun okuma üretimi sağlar (yakın 1 x 106 nükleotidler6) ve gerçek zamanlı olarak sıralama veri analizi. Barkodlama, bir örnekteki nükleik asitlere tanımlanmış nükleotid dizileri takarak, tek bir sıralamanın çalıştırılmasıyla birden fazla numunenin analizine olanak sağlayan, böylece örnek verimi artırarak ve örnek maliyetleri düşürerek mümkündür. Yüksek taşınabilirlik ve kullanım kolaylığı nedeniyle, nanopore sıralama cihazları Batı Afrika ‘da son Ebola virüs hastalığı salgını sırasında alanında başarıyla kullanılmıştır, uzak bölgelere hızlı dağıtım için uygunluğu vurgulayarak7 , 8‘ den itibaren.
Burada, Niemann-Pick C1 (NPC1) proteini için mRNA kodlama sıralaması için ayrıntılı bir alan uyumlu protokol tarif, ebolaviruses gibi filovirüsler için zorunlu giriş reseptörü olan, ve türler duyarlılık sınırlamak için gösterilmiştir Bu virüsler9,10. Protokol, tüm RNA ‘nın kan örneklerinden çıkarılması, NPC1 mRNA ‘nın RT-PCR ile spesifik amplifikasyonu, numune barkodları, Kütüphane hazırlığı ve nanopore sıralama cihazı ile sıralamayı kapsar. Veri analizi, alan sınırlamaları nedeniyle tartışılamaz, ancak bazı temel yönergeler temsili sonuçlarında sağlanır; Ancak, ilgili okuyucu daha ayrıntılı bilgi için diğer12,13,14 tarafından yayınlarının yanı sıra, kullanılan iş akışının daha ayrıntılı bir açıklaması için bir önceki yayın11 adlandırılır Bu iş akışında kullanılan analiz araçlarıyla ilgili olarak.
Son yirmi yıl içinde, biyolojik numunelerin sıralanması, çok çeşitli konu alanlarındaki çalışmaların giderek önemli bir yönü haline gelmiştir. Enzimatik manipülasyon ve görüntü tabanlı veri edinme1 yinelemeli DÖNGÜLERI kullanarak DNA özelliklerinin yoğun bir dizi sıralamasına dayalı ikinci nesil sıralama sistemlerinin geliştirilmesi önemli ölçüde artış verimi ile karşılaştırıldığında geleneksel Sanger sıralama tekniği ve çoklu numunelerin yanı sıra belirli bir örnekteki çeşitli nükleik asit türlerinin çözümlerine paralel4‘ te izin verir. Ancak, sık kullanılan ikinci nesil sistemlerin çoğu için, sadece kısa okuma üretilir ve tüm platformlar hassas, hantal ve pahalı ekipman3,4güveniyor.
İkinci nesil sıralama platformlarının aksine, bu protokolde kullanılan sıralama aygıtı nanopore teknolojisine dayanır. Burada tek telli nüklik asit molekül bir nanopore üzerinden geçer, aynı zamanda aynı nanopore üzerinden akan bir iyonik akım modülasyon sonuçlanan, ve hangi ölçülebilir ve geri-nüklik asit molekül dizisini anlamak için tercüme. Bu üçüncü nesil sıralama yaklaşımı diğer yaklaşımlar üzerinde bir dizi avantaj sunar. Bu teknolojinin benzersiz çalışma prensibi ile doğrudan ilgili ana avantajları son derece uzun okuma uzunluğu üretilen (8,8 x 105 nükleotidler kadar okuma uzunlukları6BILDIRILMIŞTIR), sadece DNA sırası yeteneği ama Ayrıca RNA doğrudan, son zamanlarda tam bir grip virüs genom17için gösterildi, ve yeteneği gerçek zamanlı olarak onlar oluşturulan gibi veri analiz etmek, hangi dakika içinde patojenler hızlı metagenomics tespiti sağlar18. Ek pratik avantajları nanopore sıralı cihazın son derece küçük boyutu, herhangi bir laboratuar veya alan misyonları uzak yerlere19,20ve diğer sıralamaya kıyasla düşük fiyat kullanımına izin verir Platform. Çalışan maliyetleri açısından, şu anda yeni bir akış hücresi her sıralama çalışması için gereklidir, hangi maliyetleri sonuçları yaklaşık $1.100 akış hücresi ve kitaplık hazırlama reaktifler için çalışma başına. Bu maliyetler, bazı durumlarda akış hücresini yıkayarak ve yeniden kullanarak veya barkodlama ve tek bir çalışma içinde birden çok numune sıralamasıyla azaltılabilir. Ayrıca, akış hücresi bir roman türü şu anda bir akış hücresi adaptörü (“flongle” olarak adlandırılır) kullanımı gerektirecektir laboratuvarları, az sayıda tarafından beta-test ediliyor ve önemli ölçüde akış hücresi fiyatını azaltmak ve böylece maliyetleri çalışıyor.
Nanopore sıralamanın büyük eksiklik doğruluğu kalır, 83 aralığında tek okuma hassasiyeti ile 86%6bildirildi,21,22, ve yanlışlıkların çoğu ekleme/silme nedeniyle neden olan ( ındels)5,21. Ancak, yüksek okuma derinliği bu yanlışlıkları telafi edebilir ve yeni bir çalışma > 10 ‘ daki okuma derinliğinin genel doğruluğu > 99.8%21‘ e yükselebileceğini kuramsal hususları temel alarak önerdi. Yine de, özellikle analiz bir fikir birliği sırası düzeyinde yerine tek bir molekül düzeyinde gerçekleştirilecek ise, doğruluk daha da iyileştirmeler gerekli olacaktır. 1D 2 teknolojisinin, aynı nanopore tarafından sıralanan tek bir DNA molekülün her iki ipine de yol açmasına neden olan 1 adet ve barkod adaptörünün (CF. Bölüm 5,5) ilavesi temelinde bulunan bu protokolde açıklandığı şekilde kullanımı, okuma Her iki DNA ipinden gelen bilgi sıra belirlenmesi için kullanılabilir beri doğruluğu. Ayrıca, diğer sıralı teknolojilerin daha yüksek doğruluk ile nanopore sıralamanın (özellikle uzun okuma uzunluğu) avantajlarını birleştirmek için takip edilebilir bir geçici çözüm stratejisi, bir iskele olarak nanopore sıralama bilgileri kullanmaktır sonra diğer platformlardan sıralama verileri kullanılarak parlatılır6.
Burada sunulan protokolün başarısı için en kritik faktör, örnek kalite ve özellikle çıkarılan RNA ‘nın miktarı ve kalitesidir. RNA ‘nın uygun depolama ve istemi ekstraksiyonu, yeterli RNA verimi elde etmeye yardımcı olur. Uygun kan toplama tüpleri kullanımı bir aya kadar kan numunelerinin depolanması sağlar, ancak kan pıhtılaşması bir sorun olabilir, özellikle örnekleri yüksek sıcaklıklarda depolanmakta olan, alan koşullarında durumda olabilir hangi. İkinci kritik adım, hedef sıraların amplifikasyonu ve özellikle alan koşullarında PCR reaksiyonları genellikle standart Laboratuar koşulları altında daha az iyi performans7. Bu amaçla, dikkatli astar tasarımı ve optimizasyonu güçlü amplifikasyon elde etmek için en önemlisi. Ayrıca, bu protokolde kullanılan iç içe PCR yaklaşımlar ve touchdown PCR, hem özgüllüğü ve hedef gen amplifikasyon duyarlılığı artırabilir4,7. Nitekim, Liberya ve Gine ‘de bu teknoloji ile iç içe protokollere sahip olan deneyimlerimiz, laboratuvar örneklerinden hedeflerin amplifikasyonu ve laboratuvar koşulları altında izin verilen astar setleri için bile alan örnekleriyle alan koşulları altında gerekli tek bir yuvarlak PCR (7 ve yayımlanmamış sonuçlar).
Bu daha kritik adımların aksine, kitaplık hazırlığı ve sıralamanın kendisi oldukça sağlam prosedürlerden ibaret. Ancak, alan koşullarında belirli ekipman parçalarının kullanılabilirliği gibi pratik sorunlar sorunlu olabilir. Örneğin, barkodlu numunelerin kütüphaneye hazırlanması öncesinde DNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir UV spektrofotometresi gereklidir. Ancak, böyle bir cihaz alan koşulları altında kullanılabilir olmamalıdır, her örnek eşit hacimli sadece büyük tarafından hafifletilmiş sonra örnek giriş malzemesi farklılıkları ile, Kütüphane hazırlama için gerekli 45 μL yapmak için kombine edilebilir okuma sayısı. Benzer şekilde, sıralı çalıştırma için internet bağlantısı gereksinimi, temel arama artık çevrimiçi olarak gerçekleştirilebilecek ancak yerel olarak yapılabilir olsa da bir sorun olabilir; Ancak, gerekirse bu zorunluluk üretici tarafından belirli koşullarda kaldırılabilir.
Özetle, sunulan protokol, uzak konumlarda da dahil olmak üzere geleneksel sıralı donanıma erişimi olmayan konumlarda nispeten düşük maliyetli sıralamaya izin verir. Kolayca herhangi bir hedef RNA veya DNA adapte edilebilir, böylece araştırmacılar çok sayıda biyolojik sorulara cevap sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, el yazması kritik okuma için Allison Groseth teşekkür ederiz. Bu çalışma, Federal tarım ve gıda (BLE) ofisi aracılığıyla Almanya Federal Cumhuriyeti Parlamentosu kararı temelinde Alman gıda ve Tarım Bakanlığı (BMEL) tarafından mali olarak destekleniyordu.
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield – Blood Collection Tube |
blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | – | MinION Mk 1B |
PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2X Master Mix |
Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
UV spectrophotometer | Implen | – | NanoPhotometer |
vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |