Özet

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

Published: March 31, 2019
doi:

Özet

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

Abstract

CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)-aracılı istikrarlı topolojik etki alanlarını ilişkilendirme (TADs) oynamak önemli bir rol TADs komşu bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri. CTCF embriyonik geliştirme, vücut desenlendirme, hematopoiesis ve leukemogenesis kontrol HOX genleri kayma ve zamansal ifade düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Ancak, olup olmadığını ve nasıl Kromatin organizasyon ve HOX gen ekspresyonu HOX ilişkili loci CTCF sınırları düzenleyen büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Geçerli protokol TAD oluşumu ve HOX gen CTCF ilişkili Kromatin sınırlarına engellemeden etkilerini incelemek için tüm CTCF bağlama HOXA/B/C/D loci Siteler’de hedefleme belirli sgRNA havuza alınan Kütüphane oluşturuldu ifade. CRISPR-Cas9 ile genetik tarama, HOXA7/HOXA9 genler (CBS7/9) arasında bulunan CTCF bağlama sitesinde kritik bir regülatör oncogenic Kromatin etki alanı, hem de Ektopik HOX gen korumak için önemli olarak belirlenmiştir MLL yeniden düzenlenmiş Akut Miyeloid Lösemi (AML) ifade desenleri. Böylece, bu sgRNA Kütüphane yaklaşım eleme içinde belirli bir gen loci aracılı CTCF genom örgüt yeni anlayışlar sağlar ve aynı zamanda her iki kodlama metin notlu genetik düzenleyici elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu için bir temel sağlar ve kodlamayan, sonrası İnsan Genom Projesi dönemde normal biyolojik süreçler sırasında.

Introduction

Son genom etkileşim çalışmaları insan nükleer genom formları hücre tipleri ve türler arasında korunmuş topolojik ilişkilendirirken etki (TADs) kararlı saptandı. Ayrı etki alanları içine genom organizasyonu kolaylaştırır ve düzenleyici elemanlarının (örneğin, arttırıcılar ve rehberleri) arasındaki etkileşimler kısıtlar. CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF) TAD sınırları bağlar ve komşu TADs1içinde bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri kritik bir rol oynar. Ancak, her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler’de etkileşim, bu kez bir hücre tipi ama diğer telkin içinde belirli bir sitenin bir Kromatin bariyer olarak çalışmasını genom geniş CTCF veri bağlama ortaya o CTCF işlevleri Kromatin sınırları2oluşumunda diğer faaliyetleri ile birlikte. Ne bilinmemektedir olsun sınır elemanları (CTCF-bağlayıcı siteleri) doğrudan CTCF biyolojik işleve bağlı olan ve nasıl bu bağlantıları ortaya olduğunu. Bu nedenle, belirli CTCF bağlayıcı siteleri genom içinde doğrudan TADs oluşumunu düzenleyen ve organizatörü/artırıcı etkileşimleri bu etki alanlarında veya komşu etki alanları arasında denetlemek öngörmekteyiz. İnsan ve fare genom sıralama projeleri ve sonraki epigenetik analizleri, genom kopyası yeni moleküler ve genetik imzaları ortaya çıkardı. Ancak, belirli imzaları/değişiklikler gen düzenlemesi ve hücresel işlev, hem de onların moleküler mechanism(s) rolü var. henüz tam olarak anlaşılması

CTCF-aracılı TADs fonksiyonel Kromatin etki alanları3,4,5temsil kanıt birden çok satırı destekler. Her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler’de etkileşim, genom geniş CTCF ChIP-seq veri CTCF bir Kromatin engel bir hücre tipi ama diğer2kez görür saptandı. CTCF genom organizasyonu4,6,7arabuluculuk tarafından geliştirme aşamasında önemli bir rol oynar. CTCF sınırları bozulma engelliler artırıcı/organizatörü etkileşimleri ve gelişimsel tıkanıklık için önde gelen Gen ekspresyonu. Bu CTCF TADs aracılı öneriyor sadece yapısal bileşenleri, aynı zamanda uygun artırıcı eylem ve gen transkripsiyonu5,8,9için gerekli yasal birimleri vardır.

HOX genleri embriyonik gelişim sırasında kritik rol oynarlar ve onlar onların ifade desenleri geçici ve dağınık şekilde kısıtlanır. HOXA locus hESCs ve IMR90 hücreleri1bir sınır CTCF ilişkili öğe anterior ve posteiror genler ayıran iki kararlı TADs oluşturur. Son raporlar gösterdi HoxBlinc, bir HoxB ilişkili locus lncRNA CTCF oluşumu aracılık eder TADs ve HOXB odağı etkileşimlerde artırıcı/organizatörü yönetti. Bu ön HOXB gen etkinleştirme sırasında ESC bağlılık ve farklılaşma10yol açar. Ayrıca, belirli bir gen loci HOXA odağı da dahil olmak üzere, CTCF İLETİMLERİNİZE TAD değişti etki alanları lineage belirli bir gen ifade profilleri aracılı ve hastalık Birleşik11,12gelişimi ile ilişkili. Kanıt CTCF gen transkripsiyonu koordine ve işlevsel etki alanlarına genom organize ederek hücre kimliğini belirlemek için birincil işlevini destekler.

Embriyonik gelişim sırasında hematopoiesis, rolü rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre (HS/PC) işlevi HOX genleri düzenler. Bu10,13,14,15yayılması ve farklılaşma arasındaki dengeyi kontrol ederek yapılır. Ifade HOX genleri sıkıca belirtimi ve hematopoetik hücrelerin en yüksek HS ifadede farklılaşma boyunca düzenlenir / PCs. HOX gen ekspresyonu yavaş yavaş azalır, en düşük fiyat seviyeleri ile olgunlaşma sırasında gerçekleşen hematopoetik hücrelerin16farklı. HOX gen bozukluk HS/PC’lerin lösemik dönüştürme17,18önde gelen dysregulating kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerine göre lösemik dönüşümünün baskın bir mekanizmadır. Ancak, kurulması ve normal oncogenic ifade desenleri HOX genleri hem de ilişkili düzenleyici ağları vs koruma mekanizması belirsizdir.

CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane tarama protein kodlayıcı genlerin19 lncRNA20 ve miRNA21 farklı türler gibi de kadar kodlamayan genler olarak sorguya çekmek için yaygın olarak kullanılmış. Ancak, yüksek üretilen iş genom sıralama sgRNA Kütüphane tarama doğrulamak için sık sık uygulandığından CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane yeni genomik hedefler belirlemek için maliyeti yüksek, kalır. Bizim sgRNA eleme sistemi belirli genom loci üzerinde odaklanmıştır ve hedefleme sgRNAs aracılığıyla tek adımlı RT-PCR marker gen ekspresyonu HOXA9gibi göre değerlendirir. Ayrıca, sıralama sgRNA genom ve Indel mutasyonlar entegre edildi doğruladı Sanger site hedefleme sgRNA tanımlamak için tespit edilebilir. Loci özgü CRISPR Cas9 genetik tarama yoluyla, CBS7/9 Kromatin sınır oncogenic Kromatin etki alanı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan Ektopik HOX gen ifade desenleri AML patogenezinde önemli bir düzenleyici olarak belirlenmiştir 12. yöntemi gelecekteki epigenetik terapi için potansiyel terapötik hedef olarak embriyonik geliştirme, hematopoiesis, leukemogenesis, aynı zamanda CTCF sınır CTCF sınır sadece belirli işlevini tanımlamak için yaygın olarak uygulanabilir.

Protocol

1. CTCF sgRNALibrary Online bir araç kullanarak tasarım CTCF bağlayıcı siteleri içinde genetik pertürbasyon platformu (GPP) tasarımcı araç (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) kullanarak insan HOX loci hedefleme sgRNA tasarım. 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA genler (şekil 1, Tablo 1) Hedefleme hed…

Representative Results

CRISPR-Cas9 teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için bir güçlü araştırma araçtır. Bu düzenleme teknikleri geleneksel gen hızla değiştirme ve genom genelinde hem bireysel gen odaklı uygulamaları için yüksek faydalı vardır. Burada, ilk tek tek klonlanmış loci özgü CRISPR Cas9 dizilmiş sgRNA kitaplığı 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA hedefleyen sgRNAs oluşan …

Discussion

SgRNA kütüphaneler genler ve ağ sgRNA zenginleştirme24,25,26 aracılığıyla belirli hücresel işlevleri düzenleyen tanımlamak için bir işlev tarama sistemi uygulanmış olan protein kodlayıcı gen ile ilgili ,27,28. SgRNA kütüphaneler gene özgü işlevsel ekranları distal ve proksimal elemanları, BCL11A, Tdgf1a ve ilaç dire…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar ayrıca el yazması düzenleme için Nicholas Cesari teşekkür ederiz. İş Ulusal Sağlık Enstitüsü (S.H., R01DK110108, R01CA204044) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Lipofectamine 3000 reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Proteinase K Thermo Fisher Scientific 25530049
Puromycin Thermo Fisher Scientific A1113802
Stbl3 cells  Life Technologies  C737303
HEK293T ATCC CRL-3216
MOLM-13 DSMZ ACC 554
lentiCRISPRv2 Addgene 52961
pMD2.G Addgene 12259
psPAX2 Addgene 12260
pGEM®-T Easy Vector Systems  Promega A137A
T4 ligase  New England Biolabs  M0202S
QIAquick Gel Extract kit QIAGEN 28706
QIAuick PCR purification kit QIAGEN 28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step Kit Bio-Rad Laboratories 1725095
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium  Thermo Fisher Scientific  11965084
RPMI 1640  Thermo Fisher Scientific 11875093
Fetal bovine serum (FBS)  Thermo Fisher Scientific 10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine  Life Technologies  10378016
Lenti-X Concentrator  Clontech 631232
Trypan Blue Solution Thermo Fisher Scientific 15250061
Polybrene Santa Cruz Biotechnology sc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Genessee Scientific  25-507
TAE buffer  Thermo Fisher Scientific  FERB49
Surveyor® Mutation Detection Kits Integrated DNA Technologies 706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc System Bio-Rad 170-8126
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5404000138
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Fisher Scientific 88870002
TSX Series Ultra-Low Freezers Thermo Fisher Scientific TSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge Series Thermo Fisher Scientific 75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water Baths Thermo Fisher Scientific FSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box Systems Thermo Fisher Scientific 13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855195
MiniAmp™ Thermal Cycler Applied Biosystems technology A37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power Supply Thermo Fisher Scientific 7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fisher Scientific 09-528-178
VWR® Tube Rotator and Rotisseries VWR International 10136-084
VWR® Incubating Mini Shaker VWR International 12620-942
Analytical Balance MS104TS/00 METTLER TOLEDO 30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ Spectrophotometer DeNovix Inc. DS-11 FX

Referanslar

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524 (2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8 (2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Luo, H., Sobh, A., Vulpe, C. D., Brewer, E., Dovat, S., Qiu, Y., Huang, S. HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries. J. Vis. Exp. (145), e59382, doi:10.3791/59382 (2019).

View Video