Biz metastazın tümör mikroortamı ile ilişkili geçici vasküler geçirgenliği değerlendirmek için iki yöntem tarif (tmem) kapı fonksiyonu ve kanser hücresi konvülsyon yüksek molekül ağırlığı İntravenöz enjeksiyon kullanarak (155 kDa) farelerde dekstran. Yöntemleri, canlı hayvanların intravital görüntüleme ve immünofluorescence kullanarak sabit doku analizi içerir.
Kanserle ilgili mortalite en yaygın nedeni metastaşı, primer tümörden ikincil sitelere kanser hücrelerinin yayılması gerektiren bir süreçtir. Son zamanlarda, primer meme kanserinde kanser hücresi yaygınlaştırılması ve akciğerde metastaz yapan ortamlarda sadece metastatik tümör mikroçevre (TMEM) denilen kapılardan oluşur. Meme kanserinde metastatik hastalığın uzak nüksü için TMEM kapı numarası prognostiktir. Tmem kapılar, bir perivasküler ile doğrudan temas içinde aktin düzenleyici protein Mena aşırı ifade eden bir kanser hücresinden oluşur, TIE2 ve VEGF yüksek düzeyde ifade eden proanjiyojenik makrophaj, bu hücrelerin her ikisi de sıkıca bir kan bağlı olduğu damar endotel hücresi. Kanser hücreleri tmem-ilişkili makrophage ve TMEM-ilişkili Mena-ifade kanser hücresi ortak aktivite tarafından düzenlenmiş geçici vasküler geçirgenlik nedeniyle t kapı yoluyla intravasate olabilir. Bu yazıda, TMEM-aracılı geçici vasküler geçirgenliğin değerlendirilmesi için iki yöntem açıklanmaktadır: intravital görüntüleme ve sabit doku immunofluorescence. Her iki yöntem de avantajları ve dezavantajları olmasına rağmen, iki birleştirerek tmem-mediated vasküler geçirgenlik ve TMEM işlevi için mikroçevresel önkoşulların en eksiksiz analizleri sağlayabilir. Meme kanserinde metastatik süreç ve muhtemelen diğer kanser türleri, TMEM kapı yoluyla kanser hücresi yayma içerir, bu TMEM kapı aktivitesinin analizi için iyi kurulan Yöntemler istihdam esastır. Burada açıklanan iki yöntem, kanser hücresini engelleyen ajanların klinik öncesi denemeleri için önemli olan saf veya farmakolojik olarak tedavi edilen hayvanlarda TMEM kapı aktivitesinin analizine kapsamlı bir yaklaşım sağlar. TMEM ile yaygınlaştırılması.
Kanser metastani anlayışımızın son gelişmeler epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve bir göç/invazif kanser hücresi alt nüfus indüksiyonu, kendileri tarafından, Hematojen yayma için yeterli olmadığını ortaya çıkardı 1. Nitekim, daha önce tümör neovasküle genellikle düşük perikayt kapsamı ile karakterize olduğu gibi kanser ilişkili endotelyum bütünlüğü ile metasürleme kanser hücrelerinin intravasate düşünülmektedir, ve bu şekilde, çok geçirgen ve kararsız2,3,4. Tümör içindeki kusurlu fonksiyonların son derece düşündürmesine karşın, karsinogenez sırasında vasküler değişiklikler, tümör hücrelerinin kan damarlarını kolayca ve kontrollü olmayan bir şekilde nüfuz edebileceğine dair kanıt sağlamaz. Tümör hücrelerinin floresan olarak etiketlendiği intravital görüntüleme (IVI) çalışmalarından gelen Öngörüler (dekstrus veya kuantum noktaları gibi), damarsal flüoresan probların (örneğin dekstran veya Quantum dots), intravenöz enjeksiyonu ile etiketlenmiştir, tümör damarlarının eşit olduğu düşük molekül ağırlığı çözeltilerini (örneğin 70 KD), yüksek molekül ağırlığı çözeltilerini (155 KD) ve tümör hücrelerinin geçirgen endotelyum sadece, bir vasküler şube noktasında tercihen bulunan konvülsyon özel sitelerde çapraz olabilir5, 6 , 7. immunohistokimyasal (IHC) analiz hayvan modelleri ve insan hasta türevi malzeme kullanarak bu sitelerin “kapı” olduğunu göstermiştir vasküler geçirgenlik düzenleyen uzmanlaşmak, yerel ve geçmeli, kısa bir pencere sağlayarak göç/invazif kanser hücreleri için fırsat dolaşım girmek için. Bu kapılar “metastaz tümör mikroçevre” veya “tmem” olarak adlandırılır, ve, oldukça expectedly, onların yoğunluğu meme kanseri hastalarda metastatik hastalık gelişimi riski ile ilişkilidir8,9, 10‘ a kadar.
Her tmem kapı hücreleri üç farklı türde oluşur: bir perivasküler makrophage, bir tümör hücresi üzerinde akin-düzenleyici protein memeli etkin (Mena) ifade, ve bir endotel hücre, hepsi birbirleriyle doğrudan fiziksel temas1, 5,9,10,11,12,13. Bir konvülsyon kapı olarak tmem işlevi için önemli olay vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) perivasküler makrophage14tarafından altta yatan gemi üzerinde lokalize salınım olduğunu. VEGF, endotel hücreleri arasındaki homotipik kavşakları bozabilir15, 16,17,18,19, geçici vasküler kaçak sonuçları bir fenomen, ayrıca “patlama” geçirgenliği olarak bilinen IVI çalışmaları 5‘ te açıklanmıştır. Tmem macrofajlar, VEGF-aracılı tmem fonksiyonu için gerekli olan Tirozin kinaz reseptörü TIE2, perivasküler niş için bu makrofajların homing ifade gösterilmiştir5,20,21 , 22. kanser hücresi yayılması ve metastezinin düzenlenmesi ek olarak, TIE2+ makrofajlar tümör anjiyogenezi merkezi regülatörleri olarak gösterildi21,22,23, 24, 25,26,27,28,29,30,31. Bu nedenle, TIE2+ macrofajlar tümör mikroortamının önemli bir bileşeni ve metastatik basamakların ana regülatörü temsil eder.
Daha iyi TMEM-aracılı vasküler geçirgenliği (yani “patlama”) kavramsallaştırmak için, endotel hücre-hücre kavşak kesilmesi ile ilişkili olmayan vasküler geçirgenlik diğer modlarından ayırt etmek çok önemlidir. Bozulmamış bir endotelium (sıkı ve yapışan kavşakların bozulmamış olduğu), vasküler geçirgenlik üç ana türü vardır: (a) pinsitoz, hangi olabilir, ya da olmayabilir, yutulan malzemenin transkyumuna birleşebilir; (b) malzemenin endotel Fenestrae ile taşınması; ve (c) endotel sıkı kavşak15,16,17,18,19,32 tarafından düzenlenmiş paracellular yolu ile malzemenin taşınması, , 33 , 34. birçok tümörde tanımlanmasına karşın, yukarıda bahsedilen vasküler geçirgenlik modları çoğunlukla normal doku fizyolojisi ve homeostaz bağlamında tanımlanmıştır, bu da aşırı olan dokuları sınırlı geçirgenlik ( Örneğin, kan-beyin bariyeri, kan-testis bariyer), ya da bol geçirgenlik (örneğin, böbrek glomerüler cihaz Fenestre kapillaries)34,35,36,37.
Multifoton intravital görüntüleme ve Multiplexed immünofluorescence mikroskopi kullanarak, meme tümörlerinde TMEM-aracılı vasküler geçirgenlik (“patlama”) ve diğer vasküler geçirgenlik modları arasında ayrım yapabiliriz. Bunu başarmak için, yüksek molekül ağırlığı, farelerde floresan etiketli prob tek bir İntravenöz enjeksiyon gerçekleştiriyoruz. Daha sonra spontan patlama olayları canlı farelerde intravital görüntüleme kullanılarak yakalanabilir; veya alternatif olarak, probun ekstrasitasyonu kan damarıyla (örn. CD31+ veya endomucin+) ortak lokalizasyon çalışmaları ve immünofluoresesans mikroskopisi kullanılarak tmem kapı ile nicelik olabilir. Burada sunulan protokoller, bağımsız olarak ya da birbirleriyle birlikte kullanılabilecek bu tekniklerin her ikisini de tarif eder.
Burada, TMEM kapılardan mevcut olan belirli bir vasküler geçirgenlik tipini görselleştirmeye ve ölçmek için uygulanabilir iki protokol özetlemektedir ve damar geçirmez ve yapışan kavşaların bozulması ile ilişkilidir. Vasküler geçirgenlik bu tür geçici ve üçlü TMEM hücre kompleksi tarafından kontrol edilir, yukarıda açıklandığı gibi5. TMEM-Associated vasküler geçirgenliği belirlemek ve ölçmek yeteneği, bir yanlısı metastatik kanser hücresi mikroortamının de…
The authors have nothing to disclose.
Biz görüntüleme desteği için Albert Einstein Tıp Koleji ‘nde analitik görüntüleme tesisi (AıF) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NCı (P30CA013330, CA150344, CA 100324 ve CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Gruss-Lipper Biophotonics merkezi ve entegre görüntüleme programı ve Montefiore ‘s Ruth L. Kirschstein T32 cerrahlar eğitim hibe tarafından destekleniyordu Tümör mikroçevre çalışması için (CA200561).
GSK el yazması, şekil 1C ve 3B için görüntüleme gerçekleştirilen, sabit doku analizi protokolü geliştirdi ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; JMP el yazması yazdı ve Şekil 1B, 2C ve 3A için cerrahi ve intravital görüntüleme yapıldı; LB & AC , şekil 2B için cerrahi ve intravital görüntüleme işlemi gerçekleştirdi; RJ , Şekil 2A için cerrahi ve intravital görüntüleme işlemi gerçekleştirdi; JSC Co-el yazması yazdı ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; Mho Co-el yazması yazdı ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; ve de şekil 2D için cerrahi ve intravital görüntüleme gerçekleştirilen, el yazması ortak yazdı, sabit doku analizi ve intravital görüntüleme protokolleri geliştirdi, ve analiz ve tüm verileri yorumlanan.
Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
Xylene | Fisher Scientific | 184835 |