Özet

Intravital görüntüleme ve sabit doku analizi kullanılarak kanserli hücre yaygınlaştırılması ile Ilişkili Metasküler kapı-aracılı vasküler geçirgenlik tümör Mikroortamının değerlendirilmesi

Published: June 26, 2019
doi:

Özet

Biz metastazın tümör mikroortamı ile ilişkili geçici vasküler geçirgenliği değerlendirmek için iki yöntem tarif (tmem) kapı fonksiyonu ve kanser hücresi konvülsyon yüksek molekül ağırlığı İntravenöz enjeksiyon kullanarak (155 kDa) farelerde dekstran. Yöntemleri, canlı hayvanların intravital görüntüleme ve immünofluorescence kullanarak sabit doku analizi içerir.

Abstract

Kanserle ilgili mortalite en yaygın nedeni metastaşı, primer tümörden ikincil sitelere kanser hücrelerinin yayılması gerektiren bir süreçtir. Son zamanlarda, primer meme kanserinde kanser hücresi yaygınlaştırılması ve akciğerde metastaz yapan ortamlarda sadece metastatik tümör mikroçevre (TMEM) denilen kapılardan oluşur. Meme kanserinde metastatik hastalığın uzak nüksü için TMEM kapı numarası prognostiktir. Tmem kapılar, bir perivasküler ile doğrudan temas içinde aktin düzenleyici protein Mena aşırı ifade eden bir kanser hücresinden oluşur, TIE2 ve VEGF yüksek düzeyde ifade eden proanjiyojenik makrophaj, bu hücrelerin her ikisi de sıkıca bir kan bağlı olduğu damar endotel hücresi. Kanser hücreleri tmem-ilişkili makrophage ve TMEM-ilişkili Mena-ifade kanser hücresi ortak aktivite tarafından düzenlenmiş geçici vasküler geçirgenlik nedeniyle t kapı yoluyla intravasate olabilir. Bu yazıda, TMEM-aracılı geçici vasküler geçirgenliğin değerlendirilmesi için iki yöntem açıklanmaktadır: intravital görüntüleme ve sabit doku immunofluorescence. Her iki yöntem de avantajları ve dezavantajları olmasına rağmen, iki birleştirerek tmem-mediated vasküler geçirgenlik ve TMEM işlevi için mikroçevresel önkoşulların en eksiksiz analizleri sağlayabilir. Meme kanserinde metastatik süreç ve muhtemelen diğer kanser türleri, TMEM kapı yoluyla kanser hücresi yayma içerir, bu TMEM kapı aktivitesinin analizi için iyi kurulan Yöntemler istihdam esastır. Burada açıklanan iki yöntem, kanser hücresini engelleyen ajanların klinik öncesi denemeleri için önemli olan saf veya farmakolojik olarak tedavi edilen hayvanlarda TMEM kapı aktivitesinin analizine kapsamlı bir yaklaşım sağlar. TMEM ile yaygınlaştırılması.

Introduction

Kanser metastani anlayışımızın son gelişmeler epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve bir göç/invazif kanser hücresi alt nüfus indüksiyonu, kendileri tarafından, Hematojen yayma için yeterli olmadığını ortaya çıkardı 1. Nitekim, daha önce tümör neovasküle genellikle düşük perikayt kapsamı ile karakterize olduğu gibi kanser ilişkili endotelyum bütünlüğü ile metasürleme kanser hücrelerinin intravasate düşünülmektedir, ve bu şekilde, çok geçirgen ve kararsız2,3,4. Tümör içindeki kusurlu fonksiyonların son derece düşündürmesine karşın, karsinogenez sırasında vasküler değişiklikler, tümör hücrelerinin kan damarlarını kolayca ve kontrollü olmayan bir şekilde nüfuz edebileceğine dair kanıt sağlamaz. Tümör hücrelerinin floresan olarak etiketlendiği intravital görüntüleme (IVI) çalışmalarından gelen Öngörüler (dekstrus veya kuantum noktaları gibi), damarsal flüoresan probların (örneğin dekstran veya Quantum dots), intravenöz enjeksiyonu ile etiketlenmiştir, tümör damarlarının eşit olduğu düşük molekül ağırlığı çözeltilerini (örneğin 70 KD), yüksek molekül ağırlığı çözeltilerini (155 KD) ve tümör hücrelerinin geçirgen endotelyum sadece, bir vasküler şube noktasında tercihen bulunan konvülsyon özel sitelerde çapraz olabilir5, 6 , 7. immunohistokimyasal (IHC) analiz hayvan modelleri ve insan hasta türevi malzeme kullanarak bu sitelerin “kapı” olduğunu göstermiştir vasküler geçirgenlik düzenleyen uzmanlaşmak, yerel ve geçmeli, kısa bir pencere sağlayarak göç/invazif kanser hücreleri için fırsat dolaşım girmek için. Bu kapılar “metastaz tümör mikroçevre” veya “tmem” olarak adlandırılır, ve, oldukça expectedly, onların yoğunluğu meme kanseri hastalarda metastatik hastalık gelişimi riski ile ilişkilidir8,9, 10‘ a kadar.

Her tmem kapı hücreleri üç farklı türde oluşur: bir perivasküler makrophage, bir tümör hücresi üzerinde akin-düzenleyici protein memeli etkin (Mena) ifade, ve bir endotel hücre, hepsi birbirleriyle doğrudan fiziksel temas1, 5,9,10,11,12,13. Bir konvülsyon kapı olarak tmem işlevi için önemli olay vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) perivasküler makrophage14tarafından altta yatan gemi üzerinde lokalize salınım olduğunu. VEGF, endotel hücreleri arasındaki homotipik kavşakları bozabilir15, 16,17,18,19, geçici vasküler kaçak sonuçları bir fenomen, ayrıca “patlama” geçirgenliği olarak bilinen IVI çalışmaları 5‘ te açıklanmıştır. Tmem macrofajlar, VEGF-aracılı tmem fonksiyonu için gerekli olan Tirozin kinaz reseptörü TIE2, perivasküler niş için bu makrofajların homing ifade gösterilmiştir5,20,21 , 22. kanser hücresi yayılması ve metastezinin düzenlenmesi ek olarak, TIE2+ makrofajlar tümör anjiyogenezi merkezi regülatörleri olarak gösterildi21,22,23, 24, 25,26,27,28,29,30,31. Bu nedenle, TIE2+ macrofajlar tümör mikroortamının önemli bir bileşeni ve metastatik basamakların ana regülatörü temsil eder.

Daha iyi TMEM-aracılı vasküler geçirgenliği (yani “patlama”) kavramsallaştırmak için, endotel hücre-hücre kavşak kesilmesi ile ilişkili olmayan vasküler geçirgenlik diğer modlarından ayırt etmek çok önemlidir. Bozulmamış bir endotelium (sıkı ve yapışan kavşakların bozulmamış olduğu), vasküler geçirgenlik üç ana türü vardır: (a) pinsitoz, hangi olabilir, ya da olmayabilir, yutulan malzemenin transkyumuna birleşebilir; (b) malzemenin endotel Fenestrae ile taşınması; ve (c) endotel sıkı kavşak15,16,17,18,19,32 tarafından düzenlenmiş paracellular yolu ile malzemenin taşınması, , 33 , 34. birçok tümörde tanımlanmasına karşın, yukarıda bahsedilen vasküler geçirgenlik modları çoğunlukla normal doku fizyolojisi ve homeostaz bağlamında tanımlanmıştır, bu da aşırı olan dokuları sınırlı geçirgenlik ( Örneğin, kan-beyin bariyeri, kan-testis bariyer), ya da bol geçirgenlik (örneğin, böbrek glomerüler cihaz Fenestre kapillaries)34,35,36,37.

Multifoton intravital görüntüleme ve Multiplexed immünofluorescence mikroskopi kullanarak, meme tümörlerinde TMEM-aracılı vasküler geçirgenlik (“patlama”) ve diğer vasküler geçirgenlik modları arasında ayrım yapabiliriz. Bunu başarmak için, yüksek molekül ağırlığı, farelerde floresan etiketli prob tek bir İntravenöz enjeksiyon gerçekleştiriyoruz. Daha sonra spontan patlama olayları canlı farelerde intravital görüntüleme kullanılarak yakalanabilir; veya alternatif olarak, probun ekstrasitasyonu kan damarıyla (örn. CD31+ veya endomucin+) ortak lokalizasyon çalışmaları ve immünofluoresesans mikroskopisi kullanılarak tmem kapı ile nicelik olabilir. Burada sunulan protokoller, bağımsız olarak ya da birbirleriyle birlikte kullanılabilecek bu tekniklerin her ikisini de tarif eder.

Protocol

Canlı hayvanları kullanan tüm deneyler hayvan kullanımı ve bakım kuralları ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmalıdır. Bu çalışmada açıklanan prosedürler, deneysel hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili Ulusal Sağlık Enstitüleri yönetmeliklerine uygun olarak ve Albert Einstein Tıp Koleji hayvan bakımı ve kullanımı onayı ile yürütülmüştür. Komitesi (ıESUC). 1. canlı hayvan görüntüleme kullanarak “patlama geçirgenliği” değerlendirilmesi …

Representative Results

Bu Protokol makalesinde açıklanan deneysel yordamlar kısaca özetlenmiştir ve Şekil 1A-C’ d e gösterilmektedir. TMEM-aracılı vasküler geçirgenliği ölçmek (“patlama aktivitesi”) ve vasküler geçirgenlik diğer modlarından deneysel gürültüyü azaltmak için (örneğin, tanıtımlarda açıklandığı gibi, transselüler ve paracellular), intravenöz (serum) yüksek moleküler ağırlık probları enjeksiyon, 155 gibi kDa dextran, t…

Discussion

Burada, TMEM kapılardan mevcut olan belirli bir vasküler geçirgenlik tipini görselleştirmeye ve ölçmek için uygulanabilir iki protokol özetlemektedir ve damar geçirmez ve yapışan kavşaların bozulması ile ilişkilidir. Vasküler geçirgenlik bu tür geçici ve üçlü TMEM hücre kompleksi tarafından kontrol edilir, yukarıda açıklandığı gibi5. TMEM-Associated vasküler geçirgenliği belirlemek ve ölçmek yeteneği, bir yanlısı metastatik kanser hücresi mikroortamının de…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz görüntüleme desteği için Albert Einstein Tıp Koleji ‘nde analitik görüntüleme tesisi (AıF) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NCı (P30CA013330, CA150344, CA 100324 ve CA216248), SIG 1S10OD019961-01, Gruss-Lipper Biophotonics merkezi ve entegre görüntüleme programı ve Montefiore ‘s Ruth L. Kirschstein T32 cerrahlar eğitim hibe tarafından destekleniyordu Tümör mikroçevre çalışması için (CA200561).

GSK el yazması, şekil 1C ve 3B için görüntüleme gerçekleştirilen, sabit doku analizi protokolü geliştirdi ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; JMP el yazması yazdı ve Şekil 1B, 2C ve 3A için cerrahi ve intravital görüntüleme yapıldı; LB & AC , şekil 2B için cerrahi ve intravital görüntüleme işlemi gerçekleştirdi; RJ , Şekil 2A için cerrahi ve intravital görüntüleme işlemi gerçekleştirdi; JSC Co-el yazması yazdı ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; Mho Co-el yazması yazdı ve analiz ve tüm verileri yorumlanan; ve de şekil 2D için cerrahi ve intravital görüntüleme gerçekleştirilen, el yazması ortak yazdı, sabit doku analizi ve intravital görüntüleme protokolleri geliştirdi, ve analiz ve tüm verileri yorumlanan.

Materials

Anti-rabbit IgG (Alexa 488) Life Technologies Corporation A-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647) Life Technologies Corporation A-21247
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Citrate Eng Scientific Inc 9770
Cover Glass Slips Electron Microscopy Sciences 72296-08
Cyanoacrylate Adhesive Henkel Adhesive 1647358
DAPI Perkin Elmer FP1490
Dextran-Tetramethyl-Rhodamine Sigma Aldrich T1287
DMEM/F12 Gibco 11320-033
Endomucin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology sc-65495
Enrofloxacin Bayer 84753076 v-06/2015
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F2442
Fish Skin Gelatin Fisher Scientific G7765
Insulin Syringe Becton Dickinson 309659
Isofluorane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Matrigel Corning CB40234 Artificial extracellular matrix
Needle (30 G) Becton Dickinson 305128
Phosphate Buffered Saline Life Technologies Corporation PBS
Polyethylene Tubing Scientific Commodities Inc BB31695-PE/1
Pulse Oximeter Kent Scientific MouseOx
Puralube Vet Ointment Dechra NDC 17033-211-38
Quantum Dots Life Technologies Corporation Q21561MP
Rubber McMaster Carr 1310N14
TMR (primary antibody) Invitrogen A6397
Tween-20 MP Biologicals TWEEN201
Xylene Fisher Scientific 184835

Referanslar

  1. Karagiannis, G. S., Goswami, S., Jones, J. G., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Signatures of breast cancer metastasis at a glance. Journal of Cell Science. 129 (9), 1751-1758 (2016).
  2. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  3. Raza, A., Franklin, M. J., Dudek, A. Z. Pericytes and vessel maturation during tumor angiogenesis and metastasis. American Journal of Hematology. 85 (8), 593-598 (2010).
  4. Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Experimental Cell Research. 316 (8), 1324-1331 (2010).
  5. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  6. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  7. Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Kanser Araştırmaları. 67 (6), 2649-2656 (2007).
  8. Sparano, J. A., et al. A metastasis biomarker (MetaSite Breast Score) is associated with distant recurrence in hormone receptor-positive, HER2-negative early-stage breast cancer. npj Breast Cancer. 3, 42 (2017).
  9. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (8), (2014).
  10. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clinical Cancer Research. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  11. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Science Signaling. 7 (353), 112 (2014).
  12. Oktay, M. H., Jones, J. G. TMEM: a novel breast cancer dissemination marker for the assessment of metastatic risk. Biomarkers in Medicine. 9 (2), 81-84 (2015).
  13. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (Mena(INV)) and Mena11a isoforms play distinct roles in breast cancer cell cohesion and association with TMEM. Clinical & Experimental Metastasis. 28 (6), 515-527 (2011).
  14. Harney, A. S., et al. The Selective Tie2 Inhibitor Rebastinib Blocks Recruitment and Function of Tie2(Hi) Macrophages in Breast Cancer and Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (11), 2486-2501 (2017).
  15. Bates, D. O., Lodwick, D., Williams, B. Vascular endothelial growth factor and microvascular permeability. Microcirculation. 6 (2), 83-96 (1999).
  16. Lee, Y. C. The involvement of VEGF in endothelial permeability: a target for anti-inflammatory therapy. Current Opinion in Investigational Drugs. 6 (11), 1124-1130 (2005).
  17. Roberts, W. G., Palade, G. E. Neovasculature induced by vascular endothelial growth factor is fenestrated. Kanser Araştırmaları. 57 (4), 765-772 (1997).
  18. Stan, R. V., et al. Immunoisolation and partial characterization of endothelial plasmalemmal vesicles (caveolae). Molecular Biology of the Cell. 8 (4), 595-605 (1997).
  19. Roberts, W. G., Palade, G. E. Increased microvascular permeability and endothelial fenestration induced by vascular endothelial growth factor. Journal of Cell Science. 108, 2369-2379 (1995).
  20. Arwert, E. N., et al. A Unidirectional Transition from Migratory to Perivascular Macrophage Is Required for Tumor Cell Intravasation. Cell Reports. 23 (5), 1239-1248 (2018).
  21. Kadioglu, E., De Palma, M. Cancer Metastasis: Perivascular Macrophages Under Watch. Cancer Discovery. 5 (9), 906-908 (2015).
  22. Hughes, R., et al. Perivascular M2 Macrophages Stimulate Tumor Relapse after Chemotherapy. Kanser Araştırmaları. 75 (17), 3479-3491 (2015).
  23. Riabov, V., et al. Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis. Frontiers in Physiology. 5, 75 (2014).
  24. Squadrito, M. L., De Palma, M. Macrophage regulation of tumor angiogenesis: implications for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 123-145 (2011).
  25. Ferrara, N. Role of myeloid cells in vascular endothelial growth factor-independent tumor angiogenesis. Current Opinion in Hematology. 17 (3), 219-224 (2010).
  26. Solinas, G., Germano, G., Mantovani, A., Allavena, P. Tumor-associated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. Journal of Leukocyte Biology. 86 (5), 1065-1073 (2009).
  27. Venneri, M. A., et al. Identification of proangiogenic TIE2-expressing monocytes (TEMs) in human peripheral blood and cancer. Blood. 109 (12), 5276-5285 (2007).
  28. Lewis, C. E., De Palma, M., Naldini, L. Tie2-expressing monocytes and tumor angiogenesis: regulation by hypoxia and angiopoietin-2. Kanser Araştırmaları. 67 (18), 8429-8432 (2007).
  29. Mazzieri, R., et al. Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells. Cancer Cell. 19 (4), 512-526 (2011).
  30. Lewis, C. E., Ferrara, N. Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors. Cancer Cell. 19 (4), 431-433 (2011).
  31. Gabrusiewicz, K., et al. Anti-vascular endothelial growth factor therapy-induced glioma invasion is associated with accumulation of Tie2-expressing monocytes. Oncotarget. 5 (8), 2208-2220 (2014).
  32. Karagiannis, G. S., Condeelis, J. S., Oktay, M. H. Chemotherapy-induced metastasis: mechanisms and translational opportunities. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  33. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  34. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  35. Satchell, S. C., Braet, F. Glomerular endothelial cell fenestrations: an integral component of the glomerular filtration barrier. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 296 (5), 947-956 (2009).
  36. Stan, R. V. Endothelial stomatal and fenestral diaphragms in normal vessels and angiogenesis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11 (4), 621-643 (2007).
  37. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Reviews. 36 (5), 564-591 (2015).
  38. Entenberg, D., et al. Imaging Tumor Cell Movement in Vivo. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-19 (2013).
  39. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  40. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  41. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. Journal of Leukocyte Biology. 83 (2), 430-433 (2008).
  42. Entenberg, D., et al. Time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  43. Pastoriza, J. M., et al. Black race and distant recurrence after neoadjuvant or adjuvant chemotherapy in breast cancer. Clinical & Experimental Metastasis. , (2018).
  44. Williams, J. K., et al. Validation of a device for the active manipulation of the tumor microenvironment during intravital imaging. Intravital. 5 (2), 1182271 (2016).
  45. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  46. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  47. Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. Journal of Cell Science. 124, 2120-2131 (2011).
  48. Karagiannis, G. S., et al. Neoadjuvant chemotherapy induces breast cancer metastasis through a TMEM-mediated mechanism. Science Translational Medicine. 9 (397), (2017).
  49. Chang, Y. S., Jalgaonkar, S. P., Middleton, J. D., Hai, T. Stress-inducible gene Atf3 in the noncancer host cells contributes to chemotherapy-exacerbated breast cancer metastasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (34), 7159-7168 (2017).
  50. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  51. Winkler, F., et al. Kinetics of vascular normalization by VEGFR2 blockade governs brain tumor response to radiation: role of oxygenation, angiopoietin-1, and matrix metalloproteinases. Cancer Cell. 6 (6), 553-563 (2004).
  52. Goel, S., et al. Normalization of the vasculature for treatment of cancer and other diseases. Physiological Reviews. 91 (3), 1071-1121 (2011).
  53. Jain, R. K. Normalizing tumor microenvironment to treat cancer: bench to bedside to biomarkers. Journal of Clinical Oncology. 31 (17), 2205-2218 (2013).
  54. Carmeliet, P., Jain, R. K. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  55. Meijer, E. F., Baish, J. W., Padera, T. P., Fukumura, D. Measuring Vascular Permeability In Vivo. Methods in Molecular Biology. 1458, 71-85 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Karagiannis, G. S., Pastoriza, J. M., Borriello, L., Jafari, R., Coste, A., Condeelis, J. S., Oktay, M. H., Entenberg, D. Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis. J. Vis. Exp. (148), e59633, doi:10.3791/59633 (2019).

View Video