Özet

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Published: July 06, 2019
doi:

Özet

Sıkı odaklı femtosaniye lazer, gerçek zamanlı gözlem ve fotostimülasyon sağlayan bir Konfokal mikroskopiye birleştirilerek hücrelere hassas stimülasyon sağlayabilir. Fotostimulasyon, ERK sinyalizasyon yolu ve reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal yanıp sönme dahil olmak üzere hücre moleküler olaylarını etkinleştirebilir.

Abstract

Hücresel tanımlı moleküler olayların doğrudan kontrolü yaşam bilimi için önemlidir. Son zamanlarda, çalışmalar femtosaniye lazer stimülasyon aynı anda birden fazla hücresel moleküler sinyalizasyon yollarını etkinleştirebilir göstermiştir. Bu protokolde, femtosaniye lazer ile bir Konfokal mikroskop içine bağlama ile göstermek, hücreler sıkı odaklı lazer tarafından tam olarak uyarılabilir. Aynı anda gözlenen bazı moleküler süreçler daha sonra aktif hale getirilebilir. Hela hücrelerinde hücre içi sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon yolunu etkinleştirmek için fotostimulasyonun ayrıntılı protokollerini sunuyoruz. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve diğer mitokondriyal olayların mitokondriyal flaşlar da belirli bir mitokondriyal tübüler yapısında femtosaniye lazer nabız odaklama uyarılabilir. Bu protokol, fotostimulasyon öncesinde hücreleri ön tedavi ederek, fotostimulasyonu hedef üzerine femtosaniye lazer flaş ile teslim ederek ve daha sonra moleküler değişiklikleri gözlemlemek/tanımlayarak içerir. Bu protokol, ilgili biyolojik araştırmalar için tüm optik bir aracı temsil eder.

Introduction

Hücresel sinyalizasyon moleküllerini kontrol etme teknolojisi, yaşam bilimin gelişiminin önemli bir parçasıdır. Geleneksel olarak, en sık kullanılan yöntem ilaçlar veya biyolojik malzemeler tarafından biyokimyasal tedavi1,2,3. Son on yıl içinde, optogenetik icat hücresel moleküler sinyal modülasyonu için yeni bir çağ açar. Gen mühendisliği ile hafif hassas proteinlerle transfeksiyon, ışık hedef hücrede çeşitli protein etkinliklerini modüle etmek için güçlü bir araç haline gelir. Bu teknoloji, sinirsel sinyalin uyarılması ve inhibisyonu, gen ifadesini teşvik etme, hücresel sinyal desenlerini manipüle etme, farklı hücreli kaderlerde önde gelen ve patolojik soruşturma gibi teşvik eden gelişmeleri4,5 ,6,7,8,9. Ancak, ışık yalnızca optogenetik proteinlerle hücreleri transferleştirerek çalışabilir. Mevcut aşamada, optogenetik dışında doğrudan hücresel molekülleri kontrol etmek için ışık sağlayan nadir yöntemler var.

Femtosecond lazer, iyi biyolojik güvenliği korurken verimli multifoton uyarma sağlayarak gelişmiş biyolojik araştırmalara sahiptir. Çeşitli fotoğraf işleme stratejilerini dağıtarak, multifoton mikroskobu, mikrocerrahi ve multifoton optogenetik uygulamalar gibi sayısız başarıları gerçekleştirmiştir10,11,12,13 ,14,15,16. Son araştırmalar, femtosaniye lazer stimülasyonunun, moleküler sinyalizasyon etkinliklerini doğrudan teşvik etmek için son derece verimli bir optik Yöntem olarak gösterilme olduğunu göstermektedir. Endoplazmik retikulum (er) üzerinde sıkı odaklı femtosaniye lazer ışınının, er ‘de kalsiyum artışını ve hücrelerde kalsiyum sinyalleri oluşturmak için kalsiyum serbest aktif kalsiyum (CRAC) kanallarını etkinleştirebileceği bulunmuştur17. Bu fotoğraf aktive kalsiyum sinyali birden fazla hücre türü arasında yayılabilir18,19,20. Ayrıca, aynı zamanda aktif T hücrelerinin nükleer faktörü (nfat) ve erk sinyalizasyon yolu21,22gibi hücre sinyalizasyon yollarını etkinleştirmek için yeteneğine sahiptir. Örneğin, hücrelerde femtosaniye lazer pozlama yoğunluğu ve lokalizasyonu ayarlayarak, mitokondri üzerinde lazer odaklama, bu mitokondriyal Morfoloji ve moleküler olayları etkileyebilir23,24, 25. özellikle, mitokondriyal Ros nesil patlamalar, mitokondri (mitoflashes) Floresan yanıp sönen olarak belirtti photostimulasyon tarafından heyecanlı olabilir.

Bu nedenle, fotostimulasyon teknolojisi, ilgili biyolojik araştırmalarda yaygın olarak uygulanacak iyi bir potansiyele sahiptir. Ayrıca mikroskobik yanı sıra hücresel sinyal molekülleri ve fonksiyonları kontrol femtosaniye lazer uygulamaları genişletmek için iyi bir şans. Burada, fotostimulasyonun teknik ayrıntılarını sağlıyoruz. Fotostimulasyon, kısa flaş photostimulasyonu olan tek bir hedef hücre sağlamak için femtosaniye lazer ile Konfokal mikroskobun bağlaması ile elde edilir. Hücredeki verimli ve kontrol edilebilir ERK aktivasyonunu başlatabilir. Photostimulasyon mitokondriyal tübüler yapısında bulunuyorsa, mitokondriyal membran potansiyeli, morfoloji, ROS ve geçirgenlik geçiş gözenekleri, fotostimulasyon ile kontrol edilebilir. Bu fotostimulasyon şemasını temel alarak, ERK sinyalizasyon yolunu etkinleştirerek ve hela hücrelerinde birden fazla mitokondriyal olayı etkileyen ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz. Bu protokol, femtosaniye lazer stimülasyon hedef hücrelere teslim sürecini elucidates.

Fotostimülasyon sistemi, eşzamanlı stimülasyon ve sürekli mikroskopide femtosaniye lazer bağlantısı olan bir Konfokal mikroskop üzerinde kurulmuştur. Femtosaniye lazer (dalga boyu: 1.040 Nm, tekrarlama oranı: 50 MHz, darbe genişliği: 120 FS, maksimum çıkış ortalama güç: 1 W) bağlantı önce iki kiriş içine ayrılır. Biri lensler bir çift oluşan bir röle teleskop aracılığıyla yönlendirilir. Daha sonra doğrudan bir objektif arka diyafram yansıtılır (60x, yok = 1,2, su daldırma) bir dikesyon-limit odak (stim-A) oluşturmak için. Diğer iki foton tarama modu (stim-B) olarak çalışmak için Konfokal mikroskop tarama optik yolu yansıtılır. Stim-A, görüş alanı (FOV) merkezinde sabit bir odak noktası sunar. Stim-B, FOV ‘de önceden tasarlanmış bir kısmi konfetit tarama alanıdır. Stim-A ve stim-B Şekil 1a‘da gösterilir. Dikroik Mirror (DM) altında bir CCD kamera femtosaniye lazer odağı izlemek için parlak alan görüntüleme sağlar.

Aşağıdaki deneyler için bazı önemli esasları vardır. Bu protokolde, örnek olarak femtosaniye Fiber Lazer kaynağı (1040 Nm, 50 MHz, 120 FS) kullanılır. Uygulamada, çoğu ticari femtosaniye osilatörler, darbe genişliği 200 FS ‘den daha kısaysa ve en yüksek güç yoğunluğu 1011 ~ 1012 W/cm2seviyesinden daha kısa olduğu sürece kullanılabilir. Örneğin, bir ti: Safir lazer genellikle multifoton microkopi için kullanılan femtosaniye lazer Şekil 1Bgösterdi yerine edebiliyoruz. Optik parametreler (darbe genişliği, dalga boyu ve tekrarlama oranı), farklı femtosaniye lazerlere göre farklı multifoton uyarma verimliliklerini artırdığından, lazer gücü ve diğer bazı fotostimulasyon parametrelerinin ayarlanması gerekir.

Femtosaniye lazer stimülasyon ile birlikte, Konfokal mikroskopide hem stim-A hem de stim-B modlarında moleküler dinamikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için sürekli hücre görüntüleme sağlar. Her iki fotostimulasyon şeması (stim-A ve stim-B) milisaniyelik çözünürlüğe sahip mekanik bir deklanşör ile kontrol edilir (Şekil 1).

Stim-A modunda, lazer odağı konumu FOV merkezinde sabit. Bir röle teleskop, dikey yönde iki lensler arasındaki mesafeyi ayarlayarak Konfokal görüntüleme düzleminde bulunan femtosaniye lazer odağı sağlamak için kullanılır (lazer yayılma yönü, konfeti görüntüleme düzlemine dikey, gösterildiği gibi Şekil 1). CCD kameranın parlak alan görüntülemesinde lazer odağı çapı ölçülebilir (~ 2 μm, Şekil 2B). Stimülasyon süreleri ve pozlama süreleri, Konfokal görüntüleme sürecinde bir deklanşör ile kontrol edilir.

Stim-B modunda, stimülasyon alanı, Konfokal görüntüleme kontrol yazılımında hat, çokgen veya daire gibi herhangi bir forma el ile önceden atanabilir. Deklanşör, Konfokal tarama işlemi ile senkronize edilir. Bu Konfokal görüntüleme kontrol yazılımı aracılığıyla ayarlanır önceden tasarlanmış zaman açılır. Ardından, stimülasyon alanı femtosaniye lazer tarafından Konfokal mikroskopi olarak taranır. Böylece, örnek sadece femtosaniye lazer tarafından uyarılır Konfokal tarama işlemi belirli bir görüntüleme çerçevesi girdiğinde.

Fotostimulasyon sistemi, deney konularına göre hem ters hem de dik Metalurji mikroskopları üzerinde kurulabilir. Petri yemekleriyle Kültürlenmiş In vitro hücreler, ters mikroskoplarla çalışmak daha iyidir. Hayvanlar, özellikle canlı hayvanların beyni, dik mikroskoplar ile daha uygundur. Bu çalışmada, ters mikroskopla örnek olarak ele alacağız. Bu petri tabağı kapağı tüm deneyler sırasında açılmamış olduğunu unutulmamalıdır.

Protocol

Dikkat: Aşağıda sunulan protokol NIR femtosaniye lazer ve toksik kimyasallar kullanarak içerir. Lütfen deneme prosedürleri tarafından indüklenen tüm olası zararlara dikkat edin. Lütfen kullanmadan önce tüm ilgili kimyasalların veya diğer malzemelerin güvenlik veri sayfalarını okuyun. Lazer kaynağını çalıştırmadan önce lütfen lazer tesislerinin güvenlik talimatlarını izleyin veya rehberlik için profesyonellere danışın. 1. deneysel hazırlık …

Representative Results

Fotostimulasyon sürekli Konfokal tarama mikroskobu ile birlikte aynı anda gerçekleştirilebilir. Fotostimulasyon zaman aşımı Konfokal mikroskopide herhangi bir önceden tanımlanmış zaman yuvasında başlayabilir. Konfoksel mikroskopide floresan görüntüleme ile hücresel molekülleri izleyebilirsiniz. Fotostimülasyon ve diğer dinamiklere moleküler tepkiler bu şekilde tespit edilebilir. Teorik olarak, Eğer ERK etkinleştirilirse, sitoplazmada fosforylated hareket olacak hü…

Discussion

Femtosaniye lazer ile bir lazer tarama Konfokal mikroskop sistemi ile birleştirerek bir fotostimulasyon stratejisi göstermektedir. Photostimulasyon, stim-B ‘ i buna göre tanımlayarak doğrudan iki foton mikroskopisi olarak çalışabilir. Biz erk sinyalizasyon veya hedef hücrelerde mitoflashes tetiklemek için femtosaniye lazer kısa bir flaş kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Farklı stimülasyon modları farklı deneysel amaçlarla ve sistemlere göre gerçekleştirilebilir. Stim-A, Konfokal mikro…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

İş Çin ‘in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81571719 ve 81661168014, 81673014 ve 81870055), Şanghay Belediye bilimi ve Teknoloji Komitesi (18QA1402300 ve 16XD1403100) ve ulusal anahtar R & D planı (2017YFA0104600) tarafından destekleniyordu.

Materials

inverted microscope Olympus
femtosecond laser Fianium
CO2 incubation system Olympus MIU-IBC
petri dish NEST 801002
petri dish with imprinted grid Ibidi 81148
ERK-GFP addgene 37145 A gift from Rony Seger's lab
mt-cpYFP A gift from Heping Cheng's lab
mito-GFP Invitrogen C10508
Tetramethylrhodamine (TMRM) Invitrogen T668 Dilute in DMSO
polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich 9002-98-6 Dilute in PBS
paraformaldehyde Solarbio P8430 Dilute in PBS
Triton X-100 Solarbio T8200 Dilute in PBS
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 9048-46-8 Dilute in PBS
Tween20 Sigma-Aldrich 9005-64-5
anti-eIF4E antibody abcam ab76256
anti-Bax antibody abcam ab53154
anti-cytochrome C antibody abcam ab90529
secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) abcam ab150077

Referanslar

  1. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature reviews Molecular cell biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  2. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (3), 165-176 (2006).
  3. Scott, J. D., Pawson, T. Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they’re apart. Science. 326 (5957), 1220-1224 (2009).
  4. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  5. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  6. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  7. Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module. Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).
  8. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), eaao3048 (2018).
  9. Steinbeck, J. A., et al. Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell–derived grafts in a Parkinson’s disease model. Nature biotechnology. 33 (2), 204-209 (2015).
  10. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  11. Hoover, E. E., Squier, J. A. Advances in multiphoton microscopy technology. Nature photonics. 7 (2), 93-101 (2013).
  12. Yanik, M. F., et al. Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy. Nature. 432 (7019), 822 (2004).
  13. Tirlapur, U. K., König, K. Cell biology: targeted transfection by femtosecond laser. Nature. 418 (6895), 290-291 (2002).
  14. Shen, N., et al. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mechanics & chemistry of Biosystems. 2 (1), 17-25 (2005).
  15. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W. P., Häusser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  16. Rickgauer, J. P., Deisseroth, K., Tank, D. W. Simultaneous cellular-resolution optical perturbation and imaging of place cell firing fields. Nature neuroscience. 17 (12), 1816-1824 (2014).
  17. He, H., et al. Manipulation of cellular light from green fluorescent protein by a femtosecond laser. Nature Photonics. 6 (10), 651-656 (2012).
  18. Smith, N. I., et al. Photostimulation of two types of Ca2+ waves in rat pheochromocytoma PC12 cells by ultrashort pulsed near-infrared laser irradiation. Laser Physics Letters. 3 (3), 154-161 (2005).
  19. Zhao, Y., Liu, X., Zhou, W., Zeng, S. Astrocyte-to-neuron signaling in response to photostimulation with a femtosecond laser. Applied Physics Letters. 97 (6), 063703 (2010).
  20. He, H., et al. Ca2+ waves across gaps in non-excitable cells induced by femtosecond laser exposure. Applied Physics Letters. 100 (17), 173704 (2012).
  21. Wang, Y., et al. All-optical regulation of gene expression in targeted cells. Scientific reports. 4, 5346 (2014).
  22. Wang, S., et al. Photoactivation of Extracellular-Signal-Regulated Kinase Signaling in Target Cells by Femtosecond Laser. Laser & Photonics Reviews. 12 (7), 1700137 (2018).
  23. Yan, W., et al. Controllable generation of reactive oxygen species by femtosecond-laser irradiation. Applied Physics Letters. 104 (8), 083703 (2014).
  24. Wang, Y., et al. Photostimulation by femtosecond laser triggers restorable fragmentation in single mitochondrion. Journal of biophotonics. 10 (2), 286-293 (2017).
  25. Shi, F., et al. Mitochondrial swelling and restorable fragmentation stimulated by femtosecond laser. Biomedical optics express. 6 (11), 4539-4545 (2015).
  26. Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
  27. Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410 (6824), 37-40 (2001).
  28. Ebisuya, M., Kondoh, K., Nishida, E. The duration, magnitude and compartmentalization of ERK MAP kinase activity: mechanisms for providing signaling specificity. Journal of cell science. 118 (14), 2997-3002 (2005).
  29. Wang, W., et al. Superoxide flashes in single mitochondria. Cell. 134 (2), 279-290 (2008).
  30. Feng, G., Liu, B., Hou, T., Wang, X., Cheng, H. Mitochondrial Flashes: Elemental Signaling Events in Eukaryotic Cells. Pharmacology of Mitochondria. , 403-422 (2016).
  31. Hou, T., Wang, X., Ma, Q., Cheng, H. Mitochondrial flashes: new insights into mitochondrial ROS signalling and beyond. The Journal of physiology. 592 (17), 3703-3713 (2014).
  32. Wang, S., Hu, M., He, H. Quantitative analysis of mitoflash excited by femtosecond laser. Journal of biomedical optics. 23 (6), 065005 (2018).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Wang, S., Hu, M., Ren, T., He, H. Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells. J. Vis. Exp. (149), e59661, doi:10.3791/59661 (2019).

View Video