Sıkı odaklı femtosaniye lazer, gerçek zamanlı gözlem ve fotostimülasyon sağlayan bir Konfokal mikroskopiye birleştirilerek hücrelere hassas stimülasyon sağlayabilir. Fotostimulasyon, ERK sinyalizasyon yolu ve reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal yanıp sönme dahil olmak üzere hücre moleküler olaylarını etkinleştirebilir.
Hücresel tanımlı moleküler olayların doğrudan kontrolü yaşam bilimi için önemlidir. Son zamanlarda, çalışmalar femtosaniye lazer stimülasyon aynı anda birden fazla hücresel moleküler sinyalizasyon yollarını etkinleştirebilir göstermiştir. Bu protokolde, femtosaniye lazer ile bir Konfokal mikroskop içine bağlama ile göstermek, hücreler sıkı odaklı lazer tarafından tam olarak uyarılabilir. Aynı anda gözlenen bazı moleküler süreçler daha sonra aktif hale getirilebilir. Hela hücrelerinde hücre içi sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon yolunu etkinleştirmek için fotostimulasyonun ayrıntılı protokollerini sunuyoruz. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve diğer mitokondriyal olayların mitokondriyal flaşlar da belirli bir mitokondriyal tübüler yapısında femtosaniye lazer nabız odaklama uyarılabilir. Bu protokol, fotostimulasyon öncesinde hücreleri ön tedavi ederek, fotostimulasyonu hedef üzerine femtosaniye lazer flaş ile teslim ederek ve daha sonra moleküler değişiklikleri gözlemlemek/tanımlayarak içerir. Bu protokol, ilgili biyolojik araştırmalar için tüm optik bir aracı temsil eder.
Hücresel sinyalizasyon moleküllerini kontrol etme teknolojisi, yaşam bilimin gelişiminin önemli bir parçasıdır. Geleneksel olarak, en sık kullanılan yöntem ilaçlar veya biyolojik malzemeler tarafından biyokimyasal tedavi1,2,3. Son on yıl içinde, optogenetik icat hücresel moleküler sinyal modülasyonu için yeni bir çağ açar. Gen mühendisliği ile hafif hassas proteinlerle transfeksiyon, ışık hedef hücrede çeşitli protein etkinliklerini modüle etmek için güçlü bir araç haline gelir. Bu teknoloji, sinirsel sinyalin uyarılması ve inhibisyonu, gen ifadesini teşvik etme, hücresel sinyal desenlerini manipüle etme, farklı hücreli kaderlerde önde gelen ve patolojik soruşturma gibi teşvik eden gelişmeleri4,5 ,6,7,8,9. Ancak, ışık yalnızca optogenetik proteinlerle hücreleri transferleştirerek çalışabilir. Mevcut aşamada, optogenetik dışında doğrudan hücresel molekülleri kontrol etmek için ışık sağlayan nadir yöntemler var.
Femtosecond lazer, iyi biyolojik güvenliği korurken verimli multifoton uyarma sağlayarak gelişmiş biyolojik araştırmalara sahiptir. Çeşitli fotoğraf işleme stratejilerini dağıtarak, multifoton mikroskobu, mikrocerrahi ve multifoton optogenetik uygulamalar gibi sayısız başarıları gerçekleştirmiştir10,11,12,13 ,14,15,16. Son araştırmalar, femtosaniye lazer stimülasyonunun, moleküler sinyalizasyon etkinliklerini doğrudan teşvik etmek için son derece verimli bir optik Yöntem olarak gösterilme olduğunu göstermektedir. Endoplazmik retikulum (er) üzerinde sıkı odaklı femtosaniye lazer ışınının, er ‘de kalsiyum artışını ve hücrelerde kalsiyum sinyalleri oluşturmak için kalsiyum serbest aktif kalsiyum (CRAC) kanallarını etkinleştirebileceği bulunmuştur17. Bu fotoğraf aktive kalsiyum sinyali birden fazla hücre türü arasında yayılabilir18,19,20. Ayrıca, aynı zamanda aktif T hücrelerinin nükleer faktörü (nfat) ve erk sinyalizasyon yolu21,22gibi hücre sinyalizasyon yollarını etkinleştirmek için yeteneğine sahiptir. Örneğin, hücrelerde femtosaniye lazer pozlama yoğunluğu ve lokalizasyonu ayarlayarak, mitokondri üzerinde lazer odaklama, bu mitokondriyal Morfoloji ve moleküler olayları etkileyebilir23,24, 25. özellikle, mitokondriyal Ros nesil patlamalar, mitokondri (mitoflashes) Floresan yanıp sönen olarak belirtti photostimulasyon tarafından heyecanlı olabilir.
Bu nedenle, fotostimulasyon teknolojisi, ilgili biyolojik araştırmalarda yaygın olarak uygulanacak iyi bir potansiyele sahiptir. Ayrıca mikroskobik yanı sıra hücresel sinyal molekülleri ve fonksiyonları kontrol femtosaniye lazer uygulamaları genişletmek için iyi bir şans. Burada, fotostimulasyonun teknik ayrıntılarını sağlıyoruz. Fotostimulasyon, kısa flaş photostimulasyonu olan tek bir hedef hücre sağlamak için femtosaniye lazer ile Konfokal mikroskobun bağlaması ile elde edilir. Hücredeki verimli ve kontrol edilebilir ERK aktivasyonunu başlatabilir. Photostimulasyon mitokondriyal tübüler yapısında bulunuyorsa, mitokondriyal membran potansiyeli, morfoloji, ROS ve geçirgenlik geçiş gözenekleri, fotostimulasyon ile kontrol edilebilir. Bu fotostimulasyon şemasını temel alarak, ERK sinyalizasyon yolunu etkinleştirerek ve hela hücrelerinde birden fazla mitokondriyal olayı etkileyen ayrıntılı bir yöntem sağlıyoruz. Bu protokol, femtosaniye lazer stimülasyon hedef hücrelere teslim sürecini elucidates.
Fotostimülasyon sistemi, eşzamanlı stimülasyon ve sürekli mikroskopide femtosaniye lazer bağlantısı olan bir Konfokal mikroskop üzerinde kurulmuştur. Femtosaniye lazer (dalga boyu: 1.040 Nm, tekrarlama oranı: 50 MHz, darbe genişliği: 120 FS, maksimum çıkış ortalama güç: 1 W) bağlantı önce iki kiriş içine ayrılır. Biri lensler bir çift oluşan bir röle teleskop aracılığıyla yönlendirilir. Daha sonra doğrudan bir objektif arka diyafram yansıtılır (60x, yok = 1,2, su daldırma) bir dikesyon-limit odak (stim-A) oluşturmak için. Diğer iki foton tarama modu (stim-B) olarak çalışmak için Konfokal mikroskop tarama optik yolu yansıtılır. Stim-A, görüş alanı (FOV) merkezinde sabit bir odak noktası sunar. Stim-B, FOV ‘de önceden tasarlanmış bir kısmi konfetit tarama alanıdır. Stim-A ve stim-B Şekil 1a‘da gösterilir. Dikroik Mirror (DM) altında bir CCD kamera femtosaniye lazer odağı izlemek için parlak alan görüntüleme sağlar.
Aşağıdaki deneyler için bazı önemli esasları vardır. Bu protokolde, örnek olarak femtosaniye Fiber Lazer kaynağı (1040 Nm, 50 MHz, 120 FS) kullanılır. Uygulamada, çoğu ticari femtosaniye osilatörler, darbe genişliği 200 FS ‘den daha kısaysa ve en yüksek güç yoğunluğu 1011 ~ 1012 W/cm2seviyesinden daha kısa olduğu sürece kullanılabilir. Örneğin, bir ti: Safir lazer genellikle multifoton microkopi için kullanılan femtosaniye lazer Şekil 1Bgösterdi yerine edebiliyoruz. Optik parametreler (darbe genişliği, dalga boyu ve tekrarlama oranı), farklı femtosaniye lazerlere göre farklı multifoton uyarma verimliliklerini artırdığından, lazer gücü ve diğer bazı fotostimulasyon parametrelerinin ayarlanması gerekir.
Femtosaniye lazer stimülasyon ile birlikte, Konfokal mikroskopide hem stim-A hem de stim-B modlarında moleküler dinamikleri gerçek zamanlı olarak izlemek için sürekli hücre görüntüleme sağlar. Her iki fotostimulasyon şeması (stim-A ve stim-B) milisaniyelik çözünürlüğe sahip mekanik bir deklanşör ile kontrol edilir (Şekil 1).
Stim-A modunda, lazer odağı konumu FOV merkezinde sabit. Bir röle teleskop, dikey yönde iki lensler arasındaki mesafeyi ayarlayarak Konfokal görüntüleme düzleminde bulunan femtosaniye lazer odağı sağlamak için kullanılır (lazer yayılma yönü, konfeti görüntüleme düzlemine dikey, gösterildiği gibi Şekil 1). CCD kameranın parlak alan görüntülemesinde lazer odağı çapı ölçülebilir (~ 2 μm, Şekil 2B). Stimülasyon süreleri ve pozlama süreleri, Konfokal görüntüleme sürecinde bir deklanşör ile kontrol edilir.
Stim-B modunda, stimülasyon alanı, Konfokal görüntüleme kontrol yazılımında hat, çokgen veya daire gibi herhangi bir forma el ile önceden atanabilir. Deklanşör, Konfokal tarama işlemi ile senkronize edilir. Bu Konfokal görüntüleme kontrol yazılımı aracılığıyla ayarlanır önceden tasarlanmış zaman açılır. Ardından, stimülasyon alanı femtosaniye lazer tarafından Konfokal mikroskopi olarak taranır. Böylece, örnek sadece femtosaniye lazer tarafından uyarılır Konfokal tarama işlemi belirli bir görüntüleme çerçevesi girdiğinde.
Fotostimulasyon sistemi, deney konularına göre hem ters hem de dik Metalurji mikroskopları üzerinde kurulabilir. Petri yemekleriyle Kültürlenmiş In vitro hücreler, ters mikroskoplarla çalışmak daha iyidir. Hayvanlar, özellikle canlı hayvanların beyni, dik mikroskoplar ile daha uygundur. Bu çalışmada, ters mikroskopla örnek olarak ele alacağız. Bu petri tabağı kapağı tüm deneyler sırasında açılmamış olduğunu unutulmamalıdır.
Femtosaniye lazer ile bir lazer tarama Konfokal mikroskop sistemi ile birleştirerek bir fotostimulasyon stratejisi göstermektedir. Photostimulasyon, stim-B ‘ i buna göre tanımlayarak doğrudan iki foton mikroskopisi olarak çalışabilir. Biz erk sinyalizasyon veya hedef hücrelerde mitoflashes tetiklemek için femtosaniye lazer kısa bir flaş kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Farklı stimülasyon modları farklı deneysel amaçlarla ve sistemlere göre gerçekleştirilebilir. Stim-A, Konfokal mikro…
The authors have nothing to disclose.
İş Çin ‘in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (81571719 ve 81661168014, 81673014 ve 81870055), Şanghay Belediye bilimi ve Teknoloji Komitesi (18QA1402300 ve 16XD1403100) ve ulusal anahtar R & D planı (2017YFA0104600) tarafından destekleniyordu.
inverted microscope | Olympus | ||
femtosecond laser | Fianium | ||
CO2 incubation system | Olympus | MIU-IBC | |
petri dish | NEST | 801002 | |
petri dish with imprinted grid | Ibidi | 81148 | |
ERK-GFP | addgene | 37145 | A gift from Rony Seger's lab |
mt-cpYFP | A gift from Heping Cheng's lab | ||
mito-GFP | Invitrogen | C10508 | |
Tetramethylrhodamine (TMRM) | Invitrogen | T668 | Dilute in DMSO |
polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | Dilute in PBS |
paraformaldehyde | Solarbio | P8430 | Dilute in PBS |
Triton X-100 | Solarbio | T8200 | Dilute in PBS |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Dilute in PBS |
Tween20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
anti-eIF4E antibody | abcam | ab76256 | |
anti-Bax antibody | abcam | ab53154 | |
anti-cytochrome C antibody | abcam | ab90529 | |
secondary antibody (anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 |