Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.
Metastaz kansere bağlı ölümlerin ana nedenidir ve metastatik hastalığı olan hastalar için sınırlı tedavi seçenekleri vardır. Metastatik hastalık için daha iyi tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracak yeni tedavi hedeflerinin tanımlanması ve test edilmesi, in vivo modellerinde preklinik preklinik gerektirir. Burada gösterilen meme kanseri metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme atamak için bir syngeneic fare modelidir. Metastatik kanser hücreleri, ateş böceği luciferase ve ZsGreen proteinlerini kodlayan viral vektörlerle şantiye edilir. Aday genler daha sonra koably luciferase / ZsGreen ifade kanser hücrelerinde manipüle edilir ve daha sonra hücreler metastatik kolonizasyon ve büyüme saymak için lateral kuyruk damarı ile fareleriçine enjekte edilir. Bir in vivo görüntüleme cihazı daha sonra zaman içinde metastatik yük değişiklikleri ölçmek için canlı hayvanlarda tümör hücrelerinin biyolüminesans veya floresan ölçmek için kullanılır. Floresan proteinin ekspresyonu, deney sonunda kesit veya histolojik boyama ya da metastaz gerekkalmadan akciğerlerdeki metastazların sayısının ve boyutunun ölçülmesine olanak tanır. Bu yaklaşım, metastatik kolonizasyon ve büyüme aday genlerin rolünü test etmek için nispeten hızlı ve kolay bir yol sunuyor, ve geleneksel kuyruk ven metastazı tahlilleri çok daha fazla bilgi sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, meme kanseri hücrelerinde PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) ile Evet ilişkili protein (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün aynı anda yıkılması nın akciğerlerde metastatik yükün azalmasına yol açtığını ve bu azaltılmış yükün metastatik kolonizasyonun ve metastazların büyümesinin azalmasısonucu olduğunu göstermektedir.
Kanser ölüm dünya çapında ikinci önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir1 ve metastaz bu ölümlerin çoğunluğu sorumludur2,3. Ancak, metastatik kolonizasyon ve sonraki büyüme yöneten moleküler mekanizmaların sınırlı bir anlayış metastatik hastalık için etkili tedavilerin gelişimini engellemiştir. Yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi, bir aday genin metastaz oluşumunu ve büyümesini nasıl etkilediğini test etmek için bir test gerektirir. Otokton fare modellerinin avantajları olsa da, zaman alıcı dır ve oluşturmak pahalıdır, bu da onları hedef bulma yerine hedef doğrulama için daha uygun hale getirir. Aday genin kanser hücrelerinde in vitro olarak tedirgin olduğu ve metastatik potansiyel üzerindeki etkilerinin in vivo olarak değerlendirildiği nakil modeli sistemleri, otokton modellere göre daha ucuz ve daha yüksek iş âldeki sistemlerdir. Buna ek olarak, RNAi, CRISPR/CAS9 ve transgenlerin istikrarlı teslimatı için viral vektörler yaygın olarak mevcuttur, bu da kanser hücresi hatlarında ilgi çeken hemen hemen her geni veya geni tedirgin etmeyi nispeten kolaylaştırır. Bu yaklaşım aynı zamanda insan kanser hücresi hatlarında metastatik kolonizasyon ve büyüme de immünozveya insanlaşmış fareler içine hücreleri naklederek aday genlerin rolünü titretmek için kullanılabilir.
Nakledilen kanser hücrelerinin in vivo tarafından metastaz oluşumunu test etmek için kullanılan iki tip tahlilssi spontan metastaz tahlilleri ve deneysel metastaz tahlilleridir. Spontan metastaz tahlillerinde4,5, kanser hücreleri farelere enjekte edilir, primer tümör oluşturmasına izin verilir, ve daha sonra spontan metastaz oluşumu ve sonraki büyüme tahlil edilir. Bu modelin gücü hücrelerin metastatik tümörler oluşturmak için metastatik sürecin tüm adımlarını tamamlamak gerekir. Ancak, birçok kanser hücre hatları spontan metastaz modellerinde verimli metastaz yok, ve primer tümör büyümesini etkileyen hücrelerin herhangi bir manipülasyon metastaz tahsin sonuçlarını şaşırtmak olabilir. Kanser hücrelerinin doğrudan dolaşıma enjekte edildiği deneysel metastaz tahlilleri bu tuzakları önlemek için kullanılır. Yaygın deneysel metastaz tahlilleri kuyruk ven enjeksiyonuiçerir 6,7,8 (ve burada gösterilmiştir), intrakardiyak enjeksiyon9, ve portal venenjeksiyonu 10.
Burada sunulan protokolün amacı, bir araştırmacının metastaz oluşumunu ve büyümesini gerçek zamanlı olarak izlemesine olanak tanıyan in vivo deneysel metastaz testi sağlamak ve aynı farenin akciğerlerindeki nokta metastaz sayısını ve boyutunu ölçmektir. Bunu başarmak için, geleneksel deneysel kuyruk ven metastaz tahlilleri6,7,8 canlı hayvan görüntüleme ile birleştirilir, in vivo görüntüleme cihazı kullanarak9,11,12,13,14. Hem luciferase hem de floresan proteini ifade eden tümör hücreleri lateral kuyruk damarı ile farelere enjekte edilir ve daha sonra in vivo görüntüleme cihazı zamanla akciğerlerdeki metastatik yükteki değişiklikleri ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Ancak, in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı ayırt edemez veya bireysel metastaz boyutunu ölçmek. Bu nedenle, deney sonunda, bir floresan stereomikroskop sayısını saymak ve kesit ve histoloji veya immünohistokimya gerek kalmadan akciğerlerde floresan metastaz boyutunu ölçmek için kullanılır(Şekil 1). Bu protokol, aday genin ekspresyonunun veya işlevinin değiştirilmesinin metastaz oluşumunu ve büyümeyi nasıl etkilediğini test etmek için kullanılabilir. Küçük moleküller veya fonksiyon bloke antikorlar gibi potansiyel terapötik bileşikler de test edilebilir.
Bu yaklaşımı göstermek için, ilk olarak metastatik fare meme kanseri hücrelerinde temel replikasyon faktörü olan replikasyon proteini A3’ün (RPA3) yıkıldığı kavram deneyinin bir kanıtını gerçekleştirdik. RPA3 nakavt hücreleri enjekte edilen farelerin kontrol hücreleri ile enjekte edilen farelere kıyasla her zaman önemli ölçüde daha az metastatik yüke sahip olduğunu gösteriyoruz. Metastaz içeren akciğerlerin analizi, bu azalan metastatik yükün metastatik kolonizasyonun önemli ölçüde azalması ve oluşan metastazların büyüme bozukluğunun bir sonucu olduğunu göstermektedir. Bu tekniği daha da göstermek için, EVET ilişkili proteinin (YAP) ve transkripsiyonel koaktivatörün PDZ bağlayıcı motifli (TAZ) aynı anda yıkılması metastatik kolonizasyonu mu yoksa sonraki büyümeyi mi bozduğunu test ettik. YAP ve TAZ, Hippo Pathway’in kritik downstream efektörleri olan iki ilgili transkripsiyonel ko-aktivatörlerdir. Biz15,16 ve diğerleri metastaz YAP ve TAZ karıştığı var(17içinde gözden ,18,19),Bu proteinleriyi tedavi hedefleri olduğunu düşündüren. Sürekli olarak, YAP/TAZ nakavt hücrelerine enjekte edilen farelerin metastatik yükü önemli ölçüde azalttığını gördük. Akciğerlerin analizi YAP/TAZ knockdown hücrelerinin çok daha az metastaz oluşturduğunu ve oluşan metastazların daha küçük olduğunu gösterdi. Bu deneyler, deneysel metastaz tahlillerinin bir araştırmacının metastaz oluşumu ve büyümesinde aday genin rolünü hızlı ve ucuz bir şekilde test etmesine nasıl olanak sağladığını göstermektedir. Ayrıca canlı hayvan görüntüleme ve tüm akciğerlerde metastaz floresan nicel kombine kullanımı nın araştırmacının metastatik kolonizasyon sırasındaki adımları daha iyi anlamasına nasıl olanak sağladığını göstermektedir.
Yöntemin kritik adımları
Belirli bir hücre hattı ve fare zorlanması için enjekte edilen hücre sayısını (adım 3) optimize etmek önemlidir, çünkü bu, oluşan metastaz sayısını ve deneyin uzunluğunu büyük ölçüde etkileyebilir. Çok fazla hücre enjekte edilirse veya metastazlar çok uzun süre büyürse, metastazların genetik manipülasyonun etkilerini değerlendirmek zorlaştıkça sayılması zor olabilir. Ancak, çok az hücre enjekte edilirse, az veya hiç metastaz oluşabil…
The authors have nothing to disclose.
Emily Norton’a viral enfeksiyonlara ve el yazmasının eleştirel okumaya yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Biz de akciğerlerde yeşil metastaz görüntü analizi ile yardım için akciğer ve Kate E. Tubbesing görüntüleri elde yardımcı olmak için Ryan Kanai teşekkür ederiz. Biz destek ve bu video hazırlanmasında yardım için hayvan araştırma tesisi personeli teşekkür ederiz. Bu çalışma, J.M.L.’ye (#CCR17477184) verilen Susan G. Komen Career Catalyst Grant tarafından desteklenmiştir.
10% SDS-PAGE Gel | For western blot | ||
2.5% Trypsin | Gibco | 15090-046 | Trypsin for tissue culture |
96 well flat bottom white assay plate | Corning | 3922 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Alcohol wipes | For sterolizing the injection site before tail vein injecitons | ||
BALB/C mice (female, 6 weeks) | Taconic | BALB-F | For tail vein metastatic colonization and burden assays |
BSA regular | VWR Ameresco | 97061-416 | For western blot |
Cell lysis buffer | Cell Signaling | For collecting protien samples | |
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm | Celltreat | 40-229749-CS | For filtering viral supernatant |
CO2 and euthanasia chamber | For euthanasing the mice | ||
Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1960 | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells |
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline | Himedia | TS1006 | For PBS |
EDTA | VWR | 97061-406 | Used to dilute trypsin for tissue culture |
FBS 100% US origin | VWR | 97068-085 | Component of complete growth media |
Fujifilm LAS-3000 gel imager | Fujifilm | For western blot | |
GAPDH(14C10) Rabibit mAb | Cell Signaling | 2118 | For western blot |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate | Thermo Scientific | 31460 | For western blot |
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT | Invitrogen | R70007 | Cell line used for packging virus |
HyClone DMEM/High clucose | GE Healthcare life sciences | SH30243.01 | Component of complete growth media |
Hygromycin B, Ultra Pure Grade | VWR Ameresco | 97064-810 | For antibiotic selection of infected cells |
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA | Molecular devices | For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells | |
Imagej | Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100 | ||
Immuno-Blot PVDF Membrane | Biorad | 1620177 | For western blot |
Isoflurane | For mouse anesthesia | ||
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) | PerkinElmer | CLS136340 | For in vivo imaging of metastatic burden |
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) | Leica Microsystems | Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | Component of complete growth media |
Lipofectamine 3000 | Life technologies | L3000008 | For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection |
Living Image 3.2 (image software program) | PerkinElmer | Software for IVIS | |
Mouse breast cancer cells, 4T1 | Karmanos Cancer Institute | Aslakson, CJ et al.,1992 | Mouse metastatic breast cance cell line |
Multi-Gauge version 3.0 | Fujifilm | Software for quantifying western blot band intensity | |
Opti-MEM (transfection buffer) | Gibco | 31985-062 | For packaging virus and transfection |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of complete growth media |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | For quantifying protein concentration |
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32957 | Added to cell lysis buffer |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Scientific | A32953 | Added to cell lysis buffer |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 45-H9268 | For infection |
Puromycin | Sigma-Aldrich | 45-P7255 | For antibiotic selection of infected cells |
Rodent restrainer | For restraining mice during tail vein injeciton | ||
SDS-PAGE running buffer | For western blot | ||
TAZ (V3886) Antibody | Cell Signaling | 4883 | For western blot |
TBST buffer | For western blot | ||
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | For counting cells | |
Vectors | See Table 1 for complete list of vectors | ||
VWR Inverted Fluorescence Microscope | VWR | 89404-464 | For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells |
Western transfer buffer | For western blot | ||
XenoLight D-Luciferin K+ Salt | PerkinElmer | 122799 | Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) | Roche | 6365787001 | For packaging virus |
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 14074 | For western blot |